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目的:运用二代测序技术从转录水平揭示雷帕霉素抑制角膜移植免疫排斥反应的机制,为药物的临床应用提供实验基础。方法:构建小鼠穿透性角膜移植模型,并随机分为同系角膜移植组(Syn组)、异系角膜移植组(Allo组)和异系角膜移植+雷帕霉素纳米胶束点眼组(Rapa组)。每组3个样本(每个样本包含3个小鼠角膜)进行角膜组织总RNA的提取,继而构建cDNA文库并进行转录组测序。经过数据质控、过滤和参考基因组比对,获得各组样本的基因表达量。以1.5倍差异即|Log2FC|>0.585和显著性P-value<0.05为条件筛选差异表达基因并对其进行基因本体(GO)以及京都基因和基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析。选取表达丰度较高且差异倍数具有统计学意义的基因,采用RT-PCR方法对其进行验证。结果:(1)与Syn组相较,Allo组共有2002个基因的表达水平发生显著改变,其中1375个基因表达上调,627个基因表达下调;经雷帕霉素干预后,Rapa组1795个基因的表达水平发生显著改变,其中737个基因表达上调,1058个基因表达下调。(2)GO富集分析显示,在Allo组上调的差异表达基因显著富集于免疫系统过程、免疫应答和免疫系统过程的调节等生物过程;经雷帕霉素干预后,在Rapa组下调的差异表达基因亦富集在上述生物过程。(3)KEGG富集分析显示,在Allo组上调的差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、单纯疱疹病毒感染、细胞粘附分子、趋化因子信号通路和NOD样受体信号通路等;经雷帕霉素干预后,下调的差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号通路和NF-κB信号通路等。在Allo组下调的差异表达基因主要富集在代谢通路、轴突导向、Hippo信号通路、Rap1信号通路和AMPK信号通路等;经雷帕霉素干预后,上调的差异表达基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、调控干细胞多能性的信号通路、Wnt信号通路、Rap1信号通路和Hippo信号通路等。(4)对 CD52、KLRD1、KLHL6、Fcer1g、CCR1 和 CCL3 进行 RT-PCR 验证,其表达趋势与RNA-Seq所得结果相符。结论:本研究通过RNA-Seq技术对雷帕霉素纳米胶束滴眼液抑制小鼠角膜移植免疫排斥反应过程中的的转录组学变化进行初步探索,发现CD52、KLRD1、KLHL6、Fcer1g、CCR1和CCL3等差异表达基因在排斥的过程中上调,经雷帕霉素干预后下调。KEGG分析显示,细胞因子-细胞因子受体相互作用和Hippo信号通路等途径参与了角膜移植免疫排斥反应的发生和雷帕霉素抑制排斥的过程。上述结果为进一步明确雷帕霉素的作用机制和寻找潜在的治疗靶点提供了转录组学基础。