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杂种优势是生物界存在的一种重要的生命现象,在动植物的生产中得到了广泛应用,但是杂种优势的分子遗传机理仍然不明确。本研究利用mRNA差异显示技术分析大白猪×梅山猪杂交组合和大白猪×长白猪杂交组合杂种与亲本之间基因差异表达的规律,并进行差异表达基因的克隆、鉴定、序列分析、组织表达谱分析及分子标记的关联分析,取得了如下结果:
1.利用mRNA差异显示技术从基因表达质与量的差异两个方面对大白猪×梅山猪杂交组合和大白猪×长白猪杂交组合的基因表达情况进行了分析,发现具有中亲优势的大白猪×梅山猪杂交组合的杂种的基因差异表达与母本效应有关,具有超亲优势的大白猪×长白猪杂交组合的杂种的基因差异表达与父本效应有关,同时发现杂种与亲本之间存在8类基因差异表达模式及两个杂交组合之间存在8类基因差异表达的模式。
2.对180日龄的大白猪×梅山猪杂交组合和大白猪×长白猪杂交组合的背最长肌中杂种与亲本之间差异表达的4个新基因进行了克隆、鉴定、序列分析和组织表达谱分析,同时用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术得到了这4个新基因的cDNA全长。结果显示:1)二磷酸腺苷核糖基化相似因子6互作蛋白5(PRA1 family protein3,PRAF3),cDNA全长1398bp,GenBank登陆号:AY864608,开放阅读框(Open reading frame,ORF)编码一个188个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与人、大鼠、小鼠的PRAF3分别具有88％、88％、87％的高度同源性,组织表达谱分析显示猪PRAF3基因在肌肉与脂肪组织中表达丰富,在脾中中等表达,在心、肾、卵巢、肺中少量表达,在肝与小肠中几乎不表达；2)碳酸酐酶Ⅲ(Carbonic anhydraseⅢ,CA-Ⅲ),cDNA全长1716bp,GenBank登陆号:AY789645,ORF编码一个260个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与人、大鼠、小鼠、马的CA-Ⅲ分别具有86％、89％、91％、91％的高度同源性,组织表达谱分析显示猪CA-Ⅲ基因不仅在肌肉中表达,而且在脾、心、肾、卵巢、肺、肝和小肠中表达；3)二磷酸腺苷核糖基化因子4(ADP-ribosylation factor4,ARF4),cDNA全长1744bp,GenBank登陆号:AY864620,ORF编码一个180个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与人、大鼠、小鼠、非洲爪蛙的ARF4分别具有96％、98％、98％、96％的高度同源性,组织表达谱分析显示猪的ARF4基因在肌肉、脂肪、心、脾、肝、卵巢等组织中表达丰富,在肾、肺中中等表达,在小肠中微量表达；4)跨膜蛋白2B(Integral membraneprotein2B,ITM2B),ORF和完整的3’非翻译区(3-untranslated region,3’-UTR)cDNA长1514bp,GenBank登陆号:AY997700,ORF编码一个266个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与人、短尾猿、小鼠和鸡4个物种的ITM2B分别具有94％、94％、92％、73％的高度同源性,组织表达谱分析显示猪ITM2B基因在肌肉、肾、卵巢、脾、心、脂肪组织中表达丰富,在小肠中少量表达,在肝与肺中几乎不表达。
3.用mRNA差异显示技术研究120日龄的大白猪、梅山猪和梅大杂交猪背最长肌中基因表达的差异,14条在杂种与纯种背最长肌中差异表达的表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)被分离,并用半定量反转录酶-聚合酶链反应(Reversetranscriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)鉴定。核苷酸序列分析表明这14个表达序列标签与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性,随后这14个EST被提交到GenBank数据库。组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、肝、肾、小肠、卵巢、肺等绝大多数组织中表达。
4.对120日龄大白猪、梅山猪和梅大杂交猪的背最长肌中差异表达的4个新基因进行了克隆、鉴定、序列分析和组织表达谱分析,用RACE技术得到了这4个新基因的cDNA全长:1)微小诱导细胞因子B10前体(Small inducible cytokine B10 precursor,CXCL10),cDNA全长1166bp,GenBank登陆号:AY789646,ORF编码一个104个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与人、猴、大鼠、小鼠的CXCL10分别具有84％、84％、70％、75％的高度同源性,组织表达谱分析显示猪CXCL10基因仅在肌肉中表达丰富,在脂肪与肾中微量表达,而在脾、心、卵巢、肺、肝和小肠中几乎不表达,采用引物步移的策略克隆出猪CXCL10基因的编码区序列(Coding sequence,CDS)基因组全长1493bp,序列提交到GenBank数据库,登陆号:AY894692,和猪的CXCL10基因的ORF的cDNA序列比较,发现该基因含有4个外显子和3个内含子；2)60S核糖体亚单位发生蛋白NIP7同源体(60S ribosome subunit biogenesis protein NIP7 homolog,NIP7),cDNA全长2136bp,GenBank登陆号；AY864609,ORF编码一个180个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与人、小鼠、大鼠的NIP7分别具有98％、97％、96％的高度同源性,组织表达谱分析显示猪的NIP7基因在肌肉、心、肺、肝、肾、脂肪中表达丰富,在小肠、脾、卵巢中微量表达,采用引物步移的策略克隆出猪NIP7基因的CDS基因组全长1759bp,序列提交到GenBank数据库,登陆号:AY974338。和猪的NIP7基因的ORF的cDNA序列比较,发现该基因含有5个外显子和4个内含子；3)转座酶10(Tramposase10,Tn10),cDNA全长2673bp,GenBank登陆号:AY864607,ORF编码一个402个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与水稻、粘质沙雷氏菌、沙门氏菌的Tn10分别具有100％的高度同源性；4)细胞色素C(Cytochrome c,CYC),全长cDNA1327bp,GenBank登陆号:AY864613,ORF编码一个105个氨基酸的蛋白质,该蛋白质与牛、羊、猪的CYC蛋白具有100％的同源性,但是比已知的牛、羊、猪的CYC蛋白多一个起始氨基酸残基M,组织表达谱分析显示猪的CYC基因在卵巢、肺、肾中表达丰富,在肌肉、脾、小肠中中等表达,在心、肝、脂肪中微量表达。
5.对120日龄的大白猪、梅山猪和梅大杂交猪背最长肌中差异表达的4个未知非编码mRNA进行了克隆、鉴定、序列分析,用RACE技术得到了这4个非编码mRNA的cDNA全长,GenBank登陆号:AY864617,AY864618,AY864619,DQ200859.
6.利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术,对4个非编码mRNA的4个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点在不同的猪群中进行了基因分型,并且与大白猪×梅山猪F2代的性状进行了关联分析,位于非编码mRNA56669bp处的C-T突变与失水率、皮率、背最长肌色值、眼肌宽、眼肌面积、系水力、胴体长、花油重、背最长肌肌内脂肪含量、瘦肉重、瘦肉率、臀部背膘厚的相关分别达显著水平(P<0.05)；位于非编码mRNA14490bp处的A-G突变与背最长肌pH值、股二头肌pH值、头半棘肌pH值、系水力、失水率、背最长肌色值、估测瘦肉率的相关分别达显著水平(P<0.05)；位于非编码mRNA44543bp处的T-C突变与胴体重、眼肌面积、平均日增重的相关分别达显著水平(P<0.05);位于非编码mRNA91505bp处的C-T突变与失水率、系水力、屠宰率、肋骨数、瘦肉率、估测瘦肉率、眼肌宽、眼肌面积的相关分别达显著水平(P<0.05).