基于衍生化Gc-MS的水稻-真菌互作代谢谱研究

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植物在自然界中不是孤立存在的,其体内外生存着各种各样的微生物。植物-微生物通过建立营养交换体系,使营养物质在植物-微生物之间流动,进而形成致病/共生关系。植物-微生物之间致病/共生关系的建立与维持必然引起寄主体内代谢物质的变化,并对植物的生长发育产生重要影响。代谢组学是一门研究生物体系受外界刺激时所产生的所有小分子代谢物变化的科学,可以从全局角度反映微生物对寄主代谢的影响。  从野生稻根部分离的内生真菌稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae)属巨座壳科(Magnaporthaceae)。同科的近缘物种多数是病原真菌,如引起水稻稻瘟病的稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)。与病原真菌不同,稻镰状瓶霉侵染定殖于水稻根部,可以显著促进水稻生长并不引起病状。基于此,本文选择稻镰状瓶霉和稻瘟菌侵染的水稻根系作为研究对象,建立了基于衍生化GC-MS的代谢物分析方法,并采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等统计分析方法对水稻代谢物变化进行了研究。主要研究成果如下:  1)建立植物-真菌互作的代谢组学取样体系和GC-MS分析体系  针对两种真菌-水稻的互作特点,成功建立用于代谢组学研究的取样方法,最大限度地排除外界因子的干扰;通过对相关文献中方法的借鉴和改进,建立了一套适合水稻-真菌互作体系的代谢组学分析方法。利用PCA、PLS-DA等统计分析方法,研究了两种真菌在水稻根系侵染不同时期引起的水稻根系和叶片的代谢物变化,并结合已有研究对其代谢途径进行解释分析。  2)结合荧光标记方法研究真菌侵染过程  采用荧光标记方法,观察了稻镰状瓶霉和稻瘟菌在水稻根部侵染不同时期的侵染行为,展示了两种真菌在水稻根系中的定殖特征。初期侵染过程相似,包括分生孢子的萌发、侵染菌丝的侵染以及在植物细胞中的穿梭;侵染中后期出现分歧,稻瘟菌可以侵染中柱细胞和维管组织,而稻镰状瓶霉侵染止步于内皮层,不侵染中柱细胞及微管组织。  3)两种真菌侵染水稻根系的代谢变化  利用建立的代谢组学方法,经过对两种真菌各个侵染时期样品的单独比较和整体分析,分别找到了两种真菌在侵染水稻过程中的差异代谢物,并进行了分析描述和宏观比较。分析结果表明:侵染初期,两种真菌侵染的寄主代谢模式相近,同样涉及到植物的防御反应、糖类物质的供应、氨基酸代谢途径以及莽草酸途径。代谢途径的不同主要在于,稻瘟菌侵染后期的莽草酸途径分流产生奎尼酸仍然存在,而稻镰状瓶霉侵染后期不存在莽草酸和奎尼酸的积累;同时稻瘟菌侵染水稻根系和叶片过程的代谢模式相近,都包含莽草酸途径和苯丙烷类次生代谢途径。  4)两种真菌侵染水稻根系对地上部生长的影响  稻镰状瓶霉局限定殖于根部,不能通过微管组织扩散到地上部分;在侵染前中期并没有引起水稻地上部分代谢变化,后期成功定殖之后表现为显著的促生效应。与之不同的是,稻瘟菌作为系统侵染性病原,在侵染前期引发水稻地上部分代谢变化,主要涉及初级代谢途径,说明植物根系和地上部分作为一个统一的有机整体,地上部的生长会受根系微生物胁迫的影响,同时,地上部会通过物质运输或信号传递为根系抵御病原侵染提供基础。
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