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鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis)是由冠状病毒属的冠状病毒引起的高度接触性传染病,是严重危害养鸡业的重要疾病之一。我国在防制鸡传染性支气管炎过程中,目前通常采用马萨诸塞(Massachusetts)血清型疫苗H120,H52,还有许多由地方分离株通过鸡胚致弱制备的商品化活疫苗。但由于我国大量鸡传染性支气管炎病毒不同血清型的出现,对感染异种IBV分离株而发病的免疫鸡群不能提供完全的保护作用,造成了我国免疫鸡群中IB频繁发生的原因之一。禽痘病毒载体疫苗在生产实践中已被证实为一种安全有效的疫苗,部分产品已经投入使用。本课题组已构建rFPV-S1-IFNγ和rFPV-S1,前期试验效果良好。本研究对其免疫效力进行了重组鸡痘病毒疫苗同弱毒疫苗比较试验、最小免疫剂量测定、安全性、遗传稳定性、不同条件保存对疫苗效价的影响等工作,为疫苗进一步的中试和推广作铺垫。 为了检测重组病毒的遗传稳定性,rFPV-S1-IFNγ与rFPV-S1用鸡胚成纤维细胞接种传代至30代,取第15、20、25、30代重组病毒作为受检代次。病毒蚀斑检测证明,重组病毒的效价在2×10~5上下波动,X-gal显色后所有蚀斑均呈蓝色;提取重组病毒基因组DNA,分别用S1和鸡Ⅱ型干扰素基因基因特异性引物进行PCR扩增,4个代次的重组病毒rFPV-S1-IFNγ均检测到了大小分别为660bp和500bp目的片段,在重组病毒rFPV-S1中也均检测到了660bp的S1基因特异性片段,序列测定表明2个外源基因在细胞传代过程中没有发生核苷酸和氨基酸的改变;间接免疫荧光检测显示各代次重组病毒中插入的外源基因均能表达,在荧光显微镜下观察到了特异性荧光。结果表明,重组鸡痘病毒具有较好的遗传稳定性,经过30代的传代后外源基因能够稳定表达。 将共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒用生理盐水恢复至原体积,取0.1ml翅膀内侧无血管处接种1周龄SPF鸡(相当于1.0×10~5PFU/羽)。结果表明,即使采用原倍重组疫苗注射试验鸡也不会引起试验鸡发病,重组疫苗对试验鸡是安全的。 将100只4周龄SPF鸡分为4个组,分别免疫rFPV-S1-IFNγ、rFPV-S1、H120,并设PBS对照,免后4周用IBV LX4株攻击。结果13/22的鸡免疫rFPV-S1-IFNγ后能获得保护,rFPV-S1免疫组和H120的保护率分别是18/24和17/22。rFPV-S1-IFNγ免疫后能缩短IBV呼吸道排毒时间及病毒抗原在肾脏组织中存在时间,仅在攻毒后的6-8d可以在喉拭子和肾脏组织中检测到病毒和病毒抗原,比rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫组分别缩短了2d。H120弱毒疫苗和重组鸡痘病毒免疫组肝、脾、肾、肺和气管的病理变化轻微,rFPV-S1-IFNγ免疫组在攻毒后的第16d观察到病理变化,比rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫组攻毒后病变持续时间短了4d。试验鸡的血清学和外周血T淋巴细胞亚群的监测表明,疫苗接种后3周全部实验鸡均为IBV抗体阳性,其中,H120弱毒疫苗免疫组抗体水平最高,其次是rFPV-S1免疫组,rFPV-S1-IFNγ免疫组的抗IBV抗体水平最低。除了rFPV-S1-IFNγ免疫组CD4~+T淋巴细胞攻毒前下降较为明显,TCRγδ~+和CD8~+T淋巴细胞比例是最高的,其余各免疫组外周血CD4~+T、CD8~+T和TCRγδ~+淋巴细胞变化水平比较平稳。上述试验结果说明rFPV-S1-IFNγ促进了CD8~+T淋巴细胞的成熟,抑制外周血中CD4~+T淋巴细胞数量。提高了机体的细胞免疫水平,限制了机体B淋巴细胞的活化以及特异性抗体的产生;同时,rFPV-S1-IFNγ还能抑制活疫苗免疫接种引起的试验鸡增重降低作用,rFPV-S1-IFNγ的免疫试验鸡的增重没有受到疫苗接种的影响,与rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫组有显著差异。