丙戊酸（valproic acid,VPA）是一种短链脂肪酸,作为镇静药物被广泛用于稳定情绪和治疗癫痫。服用VPA的孕妇,其子代罹患孤独症的比例升高。研究表明,VPA影响神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的增殖分化、神经元突起的生长及形态变化。VPA可能通过上述机制影响神经系统发育,从而导致孤独症样行为。叶酸（folicacid,FA）,又称维生素B9,作为体内重要的一碳单位传递体,在神经系统的早期发育中具有重要的作用。流行病学研究发现母体孕早期补充叶酸对神经系统的发育有一定的保护作用,可以降低子代罹患孤独症的比例,但相关机制尚不明确。研究目的:本课题组前期研究已证明FA可以改善VPA诱导的SD大鼠孤独症样行为,但相应的细胞和分子机制并不清楚。因此,本研究将建立原代NSCs及神经元的培养体系,在此基础上探究FA对VPA处理的NSCs增殖分化及神经元生长的影响及其相关的细胞和分子机制,为孤独症的预防和治疗提供一定的理论和实验依据。研究方法:将原代培养的NSCs及神经元分为四组,空白对照组（Control组）、FA对照组（FA组）、VPA组、FA预处理组（VPA+FA组）。运用MTT、BrdU等技术观察NSCs增殖的变化;运用β-tubulin和GFAP免疫荧光双重标记染色技术观察NSCs分化趋势的变化;同时运用Western Blot技术检测与细胞增殖凋亡相关的信号通路中关键信号分子AKT、ERK1/2、Bax、Bcl-2、Caspase3等蛋白表达量的变化;运用MAP-2免疫荧光染色技术观察原代神经元突起生长的变化。研究结果:1.建立了原代NSCs和神经元培养体系。原代NSCs培养体系:Nestin免疫荧光染色结果显示:培养的原代细胞中有97%为NSCs,且明场下细胞折光性良好,呈球形生长;β-tubulin、GFAP免疫荧光染色结果显示:培养的细胞中均包含β-tubulin、GFAP免疫染色阳性细胞,说明我们成功培养出了具有增殖分化能力的NSCs。原代神经元培养体系:NeuN免疫荧光染色结果显示:培养的原代细胞中约有85%的细胞为神经元,明场下胞体饱满、轮廓清晰、突起明显;MAP-2免疫荧光染色结果显示:原代神经元状态良好、突起相互交织形成网络。2.FA预处理可以逆转VPA诱导的原代神经干细胞增殖降低。以0.5-3mmol/L的VPA处理正常培养的NSCs,MTT法检测细胞活力以筛选适宜的VPA使用浓度。结果显示:当VPA的浓度为2mmol/L时,细胞存活率约为50%。后续实验分为Control组、FA（90μmol/L）组、VPA（2 mmol/L）组、FA+VPA（90μmol/L、2 mmol/L）组。MTT、BrdU、神经球直径测量结果显示:与control组相比,单独添加FA组（FA组）细胞增殖速率升高（P<0.01、P<0.05、P<0.01）;VPA组细胞增殖速率显著降低（P<0.01、P<0.01、P<0.05）。与VPA组相比,FA预处理（FA+VPA组）可以逆转VPA导致的细胞增殖降低（p＜0.05）。Western blot检测增殖与凋亡相关蛋白的表达结果表明:与control组相比,FA组ERK1/2和AKT磷酸化水平显著升高（P<0.05）而VPA组显著降低（P<0.05）;与VPA组相比,FA+VPA组ERK1/2和AKT磷酸化水平显著升高（P<0.05）。凋亡相关蛋白检测结果显示:与control组相比,VPA 组 Cleaved-Caspase3、Bax/Bcl-2 蛋白表达量显著升高（P<0.05）,而FA预处理可部分逆转这些蛋白表达水平的异常升高（P<0.05）。3.FA预处理可抑制VPA诱导的NSCs向神经元分化。β-tubulin和GFAP免疫荧光双标结果显示:与control组相比,VPA组β-tubulin阳性细胞比例显著增加（P<0.05）,FA组β-tubulin阳性细胞比例显著降低（P<0.05）;与VPA组相比,FA预处理组（FA+VPA组）β-tubulin阳性细胞比例显著降低（P<0.05）。4.FA预处理可抑制VPA诱导的原代神经元的生长。MAP-2-DAPI免疫荧光结果显示:与control组相比,VPA组神经元生长显著增加（P<0.05）,FA组神经元生长显著降低（P<0.05）;与VPA组相比,FA预处理组（FA+VPA组）神经元生长显著降低（P<0.05）。结论:1.成功建立了原代NSCs及神经元的培养体系。2.叶酸预处理可以逆转VPA诱导的原代NSCs增殖降低,叶酸可能通过调节增殖与凋亡相关蛋白的表达来调控VPA抑制的NSCs的增殖。3.叶酸可抑制VPA诱导的原代NSCs向神经元分化。4.叶酸可抑制VPA诱导的原代神经元的生长。