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目的:研究RNAi技术对人肺癌A549细胞系中STAT3基因的阻断效应,应用荧光定量PCR法和Western-blot (蛋白免疫印迹法)检测干扰前后STAT3的表达情况,探讨STAT3在肺癌发病机制中的作用,为肺癌的治疗寻找新的靶点。方法:(1)化学合成siRNA并转染A549细胞:①以肺癌A549细胞作为靶细胞,STAT3基因作为靶基因,从CNKI上搜索STAT3mRNA全基因序列, BLAST软件进行同源性分析,以STAT3mRNA全基因序列作为模板,从基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列,根据siRNA的设计原则,设计三段表达STAT3特异shRNA的基因序列,采用化学合成法合成三条双链siRNA,分别命名为sihSTAT3-1、sihSTAT3-2、sihSTAT3-3。将实验分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、sihGAPDH阳性对照组,NControl阴性对照组及A549细胞空白对照组。②采用脂质体介导方法,将合成siRNA转染各组细胞,16小时后荧光显微镜观察转染情况,观察转染效率。(2)荧光定量PCR法检测RNA干扰后STAT3mRNA表达量,得出抑制率:①以靶基因STAT3为目的基因、管家基因β–actin为内参基因。转染24h后收集细胞,用TRIZOL法提取RNA,逆转录成cDNA,琼脂糖凝胶电泳,检测目的条带。②于转染24h、48h、72h分别收集细胞,经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得靶基因STAT3及管家基因β-actin的cDNA产物,并作为标准品梯度稀释,采用SYBR Green I定量PCR检测,得出标准曲线,溶解曲线及扩增曲线。③采用相对定量比较域值法计算STAT3mRNA相对表达倍数,得出抑制率,进行统计学分析。(3)应用Western- blot法检测干扰后STAT3蛋白表达抑制率:①选择一干扰效率较高siRNA对各组中的STAT3蛋白进行Western- blot检测,用Bradford比色法测定蛋白含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)、考马斯亮蓝染色观察蛋白条带、电转移(electrotransfer)封闭PVDF膜、免疫反应(加入一抗和二抗)、化学发光显示目的条带。②将Western-blot结果扫描传送至计算机,用Image-Proplus图像分析软件系统对蛋白条带进行分析,以蛋白条带的灰度值代表蛋白的表达量,用β-actin条带灰度值进行校正,得出各条带的相对灰度值。统计学分析结果。结果:(1)成功设计合成siRNA,并成功转染肺癌A549细胞。(2)荧光定量PCR结果显示,在转染24h、48h、72h后,各干扰组与阴性组比较STAT3基因表达量明显下调(P<0.05),siRNA-STAT3对STAT3基因的表达均抑制,其中0到48小时抑制率呈明显上升趋势,48小时到72小时抑制率变化不明显。对应不同位点的三个siRNA-STAT3对STAT3mRNA表达的抑制率无明显差异(P>0.05);阴性对照及空白对照STAT3表达量无明显差异(P>0.05)。(2)Western blot显示:转染前后STAT3蛋白的表达水平明显受到抑制,抑制率为76.92%,具有显著差异(P<0.05),内参基因在各组的表达量无明显差异。结论:(1)本实验利用化学合成法成功合成了针对STAT3基因的siRNA,成功建立了STAT3基因RNA干扰技术(。2)将合成的siRNA转染入A549细胞后,通过荧光定量PCR检测STAT3基因表达量,和通过Western-blot检测STAT3蛋白表达量,结果显示:转染后STAT3mRNA及蛋白表达量均明显受到抑制,而对内参基因的表达影响不大,说明合成的siRNA对STAT3有高效和特异的沉默作用。(3)本实验利用RNAi技术,有效地抑制肺腺癌A549细胞中STAT3基因的表达,诱导细胞凋亡。为进一步探索STAT3基因在肺癌发生发展中的重要作用奠定了基础,并为在肺癌的治疗中寻找更有效的靶点提供了方向