引言：类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种病理特征为关节滑膜组织炎性增生和关节软骨进行性破坏的常见慢性自身免疫性疾病。IgD包括分泌型IgD（secreted IgD, sIgD）和膜结合型IgD （membrane IgD, mIgD）。它们在免疫系统中发挥调控作用,如增强IgM、IgG或IgA参与的保护性的抗原反应；参与对抗外来病毒入侵的粘膜免疫；在记忆B细胞的转换和生成过程中也发挥重要作用。IgD除了本身作为B细胞表面受体,还可与膜受体即IgD受体（IgD receptor, IgDR）结合发挥功能,人类和小鼠T细胞上均有IgDR的表达。IgD与T细胞上IgDR相互作用可导致抗原特异性T细胞克隆增加,B细胞上mIgD与T细胞上IgDR父联可以抑制T细胞凋亡。临床发现,自身免疫病患者包括RA、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）血液中sIgD水平升高,IgD转基因小鼠模型发现小鼠的皮肤溃疡、肝、脾、肾均出现异常肿大,可能与血清中sIgD高表达有很大关系。已有研究推测IgD在自身免疫病的免疫应答中具有重要作用,IgD水平的升高可导致炎症和免疫性组织损伤。胶原性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）模型兼具细胞免疫和体液免疫的特点,是评价药物治疗RA的药效以及进行机制研究的公认模型。国外学者发现利用抗IgD抗体对小鼠CIA的有治疗作用,这些研究引起国内外学者对IgD的关注。RA的发病机制与T、B淋巴细胞的异常活化有关,成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）类肿瘤样增生是RA的特征性病理表现。有关RA患者中T、B细胞和FLS上IgD和IgDR表达的研究至今未见报道。IgD和IgDR在RA中是否表达异常,是否参与RA中T、B细胞的活化,FLS的异常增生和炎性因子的释放?还有待研究发现。本课题以RA患者和健康对照者组织样本为研究对象,以不同信号分子的激动剂、拮抗剂等为工具,采用免疫磁珠分选、流式细胞术、免疫印迹和激光共聚焦等技术,观察IgD及IgDR在健康对照者和RA患者外周血T、B细胞上的表达差异及IgD对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）的增殖、T、B细胞亚群、分泌的细胞因子水平、IgDR的表达及下游信号的影响；同时观察IgD及IgDR在FLS中的表达,及IgD对FLS的细胞增殖、分泌的细胞因子水平及IgDR表达的影响。拟阐明IgD和IgDR参与RA淋巴细胞及FLS异常活化的可能机制,为发现RA新的病理机制以及以IgD-IgDR信号为治疗RA的新靶点提供实验依据。目的：观察IgD及IgDR在健康对照者和RA患者外周血T、B细胞和FLS上的表达差异及IgD对PBMC中T、B细胞和FLS细胞功能的影响及机制。为阐明IgD和IgDR参与RA淋巴细胞及FLS异常活化的可能机制,并且为以IgD-IgDR信号为治疗RA的新靶点提供实验依据。方法：选取54例活动期且无治疗药物干扰的RA患者及42例年龄、性别相匹配的健康体检者入选本研究。收集临床相关资料及RA患者外周血和健康对照者外周血,酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测血清中sIgD和人可溶性核因子κB受体活化因子配基（nuclear factor-κB ligand, sRANKL）水平；分离PBMC和滑膜组织中FLS,流式细胞仪检测T、B细胞和FLS细胞上mIgD及IgDR的表达状况,分析两组人群中的表达差异,研究IgD及IgDR的表达与RA疾病的相关性。IgD各浓度组体外诱导后,CCK-8法检钡PBMC和FLS的细胞活力；抗体芯片检测PBMC和FLS培养上清中细胞因子IL-1β、IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-13、TNF-α和MCP-1的水平；流式细胞仪检测PBMC中T细胞亚群(CD³⁺/CD⁴⁺、CD³⁺/CD⁸⁺、CD⁴⁺/CD62L⁺、CD⁴⁺/CD154⁺、CD⁴⁺/CD69⁺、 CD³⁺/CD8^-/IL-17⁺、 CD⁴⁺/CD25⁺/FoxP3⁺)和B细胞亚群（CD19⁺/CD21+、 CD19⁺/CD23+、CD19-/CD138⁺、CD19⁺/IgM⁺/IgD-、CD19⁺/IgD⁺、CD19⁺/CD27⁺、百分比及CD19⁺/IgD⁺/CD27-、CD19⁺/IgD⁺/CD27⁺、CD19⁺/IgD-/CD27⁺）的表IgDR达。免疫磁珠分选CD⁴⁺T细胞,法检测western blot和IgDR.Lck（Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase）的蛋白表达。激光共聚焦显微镜观察P-Lck在FLS上IgDR的分布。荧光标记的配体受体亲和力实验检测IgD与CD⁴⁺T细胞和FLS上结IgDR合的亲和力。结果：1.IgD和在RA患者和健康对照者中的表达差异。IgDRRA患者血清中和sIgD水平显著高于健康对照者。RA血清中sRANKL与sIgD类风湿因子sRANKL.和C反应蛋白（rheumatoid factor,RF）正相关,其中（C-reactive protein, CRP）与sRANKL的相关性最高；与血沉sIgD和抗环瓜氨酸肽（erythrocyte sedimentation rate,ESR）无显著相关性。RA患者和健康对照者的T细胞表面几乎不表达（anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP）与健康mIgD。对照者相比,RA患者的Th细胞和成熟B细胞(CD³⁺/CD⁴⁺)百分比（CD19⁺/IgD⁺）显著升高,未成熟B细胞显著降低。建立了流式细胞术检测（CD19⁺/IgM⁺/IgD-）IgDR表达的方法,发现T细胞和B细胞表面均有的表达,且RA患者表IgDR达IgDR的总T细胞)和表达(CD³⁺/IgD⁺的Th细胞IgDR的(CD³⁺/CD⁴⁺/IgDR⁺)细胞亚群百分比显著升高（P<0.05）,表达的总B细胞IgDR)在两组（CD19⁺/IgDR⁺）人群中无显著性差异。2.IgD对功能的影响。IgD（1～10μg/ml）从24h即可明显促进RA患者PBMC的增殖,起效时间与健PBMC康对照者相同。且RA患者对IgD的刺激作用较健康对照者更敏感。与PBMC对照组相比可显著降低RA患者和健康对照者的未致敏Th细胞IgD（10μg/ml）的百分比,增加表达CD40L的Th细胞(CD⁴⁺/CD62L⁺)和早期活(CD⁴⁺/CD154⁺)化Th细胞(CD⁴⁺/CD69⁺)的百分比。并且通过比较IgD对RA患者和健康对照者作用后发现,IgD未诱导前RA患者早期活化Th细胞比健康对照者高,IgD各浓度组诱导后,RA患者早期活化Th细胞增加程度显著高于健康对照者,提示IgD促进RA患者的T细胞活化作用更加显著。IgD刺激24h后,可显著增加健康对照者Th17细胞亚群(CD³⁺/CD8-/IL-17+)的百分比,减少Treg细胞亚群(CD⁴⁺/CD25+/FoxP3+)的百分比,致使Th17/Treg失衡。与对照组相比IgD（10μg/ml）均可显著增加健康对照者和RA患者的表达补体受体B细胞（CD19⁺/CD21+）,表达Fc受体B细胞（CD19⁺/CD234）的百分比、浆细胞（CD19^-/CD138⁺）和成熟B细胞（CD19⁺/IgD⁺）的百分比（P<0.05）。IgD未诱导前RA患者中表达Fc受体B细胞百分比显著高于健康对照者（P<0.05）,未成熟B细胞百分比低于健康对照者,IgD诱导后RA患者表达Fc受体B细胞百分比增加显著高于健康对照者,并且使健康对照者未成熟B细胞降低到RA患者水平。IgD可以显著增加RA患者PBMC培养上清中IL-1αIL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的水平的水平,且IgD促进RA患者分泌炎性细胞因子TNF-α作用更加显著。3.IgID对IgDR表达及T细胞蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）信号通路的影响。IgD可促进IgDR在RA患者及健康对照者T细胞和B细胞中的表达。IgDR在T细胞和B细胞中的基础表达均<5%,在健康对照者PBMC中,IgD诱导后T细胞和B细胞表面IgDR表达可分别增加5倍和3倍以上。RA患者PBMC中对IgD的刺激更加敏感,T细胞表面IgDR表达可增加12倍以上。分选健康对照者CD⁴⁺T细胞后western blot法发现IgD可时间依赖性和浓度依赖性的上调IgDR的蛋白表达,与流式细胞仪检测结果相一致。IgD可上调T细胞P-Lck蛋白表达。IgD（3μg/ml）合用PTK抑制剂Herbimycin A或Lck抑制剂A770041后,Herbimycin A(1 μM和A770041（0.15μM）均可显著抑制IgD上调p-Lck的表达。与对照组相比IgD （3 μg/ml）可以显著促进CD⁴⁺T细胞增殖,先用抑制剂Herbimycin A(1 μm或A770041（0.5μM）阻断PTK信号通路后,IgD（3 μg/ml）促进CD⁴⁺T细胞增殖作用被明显抑制。4.IgID对FLS功能及IgDR表达的影响。研究表明,人FLS膜表面未见mIgD表达,可见IgDR表达。利用激光共聚焦技术发现FLS胞膜和胞浆均有IgDR的表达,且RA患者FLS（RA-FLS）中IgDR的表达高于健康对照者（HC-FLS）。IgD（10μg/ml）从24h即可明显促进RA-FLS的细胞增殖（P<0.05）,起效时间早于HC-FLS （48h）, RA-FLS对IgD的刺激作用更敏感。与对照组相比,IgD可显著增加RA-FLS培养上清中IL-β,IL-6,MCP-1和TNF-α的水平。利用流式细胞检测和western blot检测技术发现,IgD可以浓度依赖性的增加RA-FLS表面IgDR表达。建立了非放射性荧光标记的配体受体结合实验,首次检测了IgD与IgDR结合的作用特性。流式细胞术检测IgD与人CD⁴⁺T细胞上IgDR结合的Scatchard直线方程Y=-25.125X+137428（r=-0.937）,得出解离常数KD和受体最大结合容量Bmax分别是0.216rnM和5470 arbitrary unit/104 cells。 IgD与FLS上IgDR结合的Scatchard直线方程Y=-80.224X+498634（r=-0.908）,得出解离常数KD和受体最大结合容量Bmax分别是0.067nM和6215arbitrary unit/10⁴ cells 。 IgD与CD⁴⁺T细胞和FLS细胞上IgDR都可结合,且IgD结合FLS上IgDR的亲和力更大。结论：1.RA患者外周血中sIgD高于健康对照者,且RA患者血清中高水平的sIgD与sRANKL、RF和CRP水平呈正相关。2. mIgD主要表达在B细胞表面,T细胞和FLS表面不表达mIgD,人T、B细胞和FLS表面均表达IgDR,且RA患者表达更高。IgD与CD⁴⁺T细胞和FLS细胞上IgDR都可结合,解离常数KD值分别是0.216nM和0.067nM, IgD结合FLS上IgDR的亲和力更大。3.IgD促进PBMC的细胞增殖、T、B细胞的活化和炎性细胞因子的分泌可能与其作用于IgDR、活化Lck有关。RA患者对IgD的刺激作用更敏感。4.IgD可能通过与IgDR交联促进FLS的细胞增殖、炎性细胞因子、趋化因子的分泌,参与RA患者关节滑膜增生和炎性病变。IgD-IgDR信号的调控可能成为治疗RA的新策略。