论文部分内容阅读
树木次生木质部的发育过程即木材形成过程,包括维管形成层细胞分裂、细胞伸展伸长、次生壁加厚和细胞编程死亡等事件。本研究使用毛白杨（Populus tomentosa Carr.）与欧洲黑杨（Populus nigra L.）作为实验材料,研究了木材形成过程中可能参与木质部细胞程序化死亡的类caspases蛋白酶、PtVPE（vacuolar processing enzyme）及PtCDD(Ca2+-dependent DNase)的活性和作用。得到如下主要结论:1.用荧光底物法测定了欧洲黑杨未成熟木质部中的类caspase1-9的活性,其中DEVDase活性最高,其次为VEIDase的活性,YVADase与LEVDase也呈现出一定的活性。Ac-DEVD-CHO抑制剂对DEVDase活性抑制作用最大,活性只有对照的17.3%。由于pH值能调控植物中类caspases活性,DEVDase活性在pH值4.0最高,最适pH值范围为3.5-4.5。用caspase-3专一性可逆与不可逆抑制剂处理欧洲黑杨二年生枝条,用Ac-DEVD-CHO与Ac-DEVD-CMK抑制剂混合处理,明显导致形成层区域加厚。通过TUNEL反应,用Ac-DEVD-CHO与Ac-DEVD-CMK抑制剂混合处理的枝条中TUNEL信号明显减少。这表明caspase-3抑制剂能阻止杨树木材形成过程中的细胞程序性死亡,类caspase-3/DEVDase可能参与了树木木质部细胞发育中的细胞程序性死亡过程。2.以毛白杨叶片为材料,在其基因组DNA中分别克隆得到PtNAC068与PtNAC154的启动子,长度分别为901bp与668bp,分别命名为ProNAC068与ProNAC154,将该片段置换pBI121载体中的CaMV35S启动子,构建植物表达载体ProNAC068::GUS和ProNAC154::GUS,并将其转化84K杨,获得杨树转基因植株。经GUS活性检测分析发现,PtNAC068启动子主要在根、茎、叶与叶柄次生维管组织中启动基因特异表达,PtNAC154启动子在茎、叶与叶柄发育中的木质部启动基因特异表达。RT-qPCR结果表明,GUS在ProNAC068::GUS转基因植株中的表达量是在ProNAC154::GUS转基因植株中的30倍。PtNAC068与PtNAC154启动子表达模式的差异说明了这两个基因可能参与了维管组织发育的两个不同方面,从而为下一步构建维管组织特异表达载体奠定基础。3.利用RT-PCR方法,从毛白杨未成熟木质部的cDNA中分离出γ-PtVPE基因,其cDNA完整的开放阅读框（ORF）共编码493个氨基酸。以pBI121为表达载体,构建了在CaMV35S启动子与ProNAC068启动子驱动下的正义和反义植物表达载体pBIRNAi-PtVPE、pBI121-CaMV35S-sensePtVPE、pBI121-ProNAC068-sensePtVPE与pBI121-ProNAC068-antisensePtVPE。在此基础上,通过农杆菌介导的叶盘法与花序浸染法,将构建好的表达载体转化到杨树中,将两个正义表达载体转化到拟南芥中。经PCR检测分别得到了杨树与拟南芥转基因植株。PtVPE超表达导致转基因拟南芥生长缓慢,叶片表皮毛明显减少,叶片总长显著降低,茎与胚轴次生木质部增厚;ProNAC068启动的PtVPE正义表达导致转基因拟南芥叶片光滑,无表皮毛,叶片长度有所变短,次生生长量较多,茎与胚轴次生木质部增厚。该结果说明PtVPE对植物的生长发育有重要影响,特别是对次生生长具有调控作用。4.以pBI121为基础,构建了在CaMV35S启动子与ProNAC068启动子驱动下的植物表达载体pBI121-CaMV35S-sensePtCDD、pBI121-ProNAC068-sensePtCDD与pBI121-ProNAC068-antisensePtCDD。利用诱导型植物表达载体PX6,构建了PX6-PtCDD正义表达载体。将表达载体转化杨树、烟草与拟南芥,经PCR检测得到了转基因植株。通过对转基因植株的表型分析,发现ProNAC068驱动PtCDD超表达的转基因拟南芥营养生长阶段茎端分生组织受到破坏,促进腋生分生组织的生长,抽薹时间要比野生型植株晚12-14天。同样,在CaMV35S驱动PtCDD超表达的转基因烟草中,顶端生长点死亡,失去顶端优势,从叶腋处生长出新的侧芽,从而导致转基因烟草生长缓慢。在超表达的PtCDD转基因杨树中,在正义表达的PtCDD转基因杨树中,无明显的主茎,出现3-5个侧枝。这些结果说明该核酸酶可能诱导细胞死亡,从而影响顶端分生组织的活性,导致主茎发育受阻。