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多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome,PCOS)是育龄期妇女最常见的、以高雄激素血症为显著特征的的内分泌紊乱性疾病,主要表现为高雄激素、排卵障碍和卵巢多囊样改变,常伴有胰岛素抵抗、肥胖以及慢性炎症等,是导致女性不孕症的主要病因之一。由于PCOS病因复杂,尚缺乏有效的防治手段,临床治疗均以改善症状为主。褪黑素(melatonin,MT)是一种主要由哺乳动物松果体腺分泌的神经胺类激素,调控机体中枢和外周系统与昼夜节律和生殖有关的机制,并具有强大的抗氧化、抗炎、抑制凋亡、抑制肿瘤、调节自噬和内分泌功能等作用。已有大量研究表明MT在女性生殖系统疾病中发挥重要作用。研究报道,卵巢组织可合成MT,也有褪黑素受体(melatoninreceptor,MTR)的存在;MT可以改善PCOS模型大鼠代谢和生殖紊乱;一项临床的初步研究也表明褪黑激素治疗可能恢复PCOS女性的月经周期。然而,目前有关褪黑素对PCOS防治作用的具体机制尚不明确。PCOS患者与正常人群体内的MT水平有无差异?MT的差异表达是否与PCOS临床表现相关?MT保护PCOS的具体机制是什么?为了解决这些问题,本课题首先采用人群标本,明确卵泡液中MT表达水平在PCOS人群与正常人群之间的差异,并与性激素水平和炎症因子表达具有相关性;随后建立DHEA诱导的PCOS大鼠模型,深入探讨MT保护PCOS的可能机制是通过调节自噬;最后,通过细胞实验进一步阐明MT通过激活PI3K-AKT通路抑制自噬发挥保护作用。本次研究探讨了褪黑素保护PCOS发生发展的可能机制,为探索MT治疗PCOS的新途径提供理论依据。研究一卵泡液褪黑素水平在PCOS患者与非PCOS人群的表达差异及相关性研究目的1.探讨卵泡液褪黑素水平在PCOS患者与非PCOS人群的表达是否存在差异;2.探讨卵泡液褪黑素水平在PCOS患者与非PCOS人群的差异表达是否与血清性激素以及卵泡液炎症因子存在相关性。方法PCOS组人群38例,对照组人群(非PCOS人群)50例,分别收集卵泡液与卵巢颗粒细胞;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)测定卵泡液MT水平以及炎症因子水平;采用Pearson相关系数对卵泡液MT表达和血清性激素以及卵泡液炎症因子的表达进行线性相关分析;采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应(Real-timequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测颗粒细胞褪黑素受体(MTR)、性激素受体、炎症因子、炎症信号通路以及氧化应激指标mRNA表达水平;所有患者就诊时均进行空腹血糖、空腹胰岛素、性激素及甲状腺激素的检查。结果1.PCOS组人群卵泡液MT表达低于对照组水平,差异具有显著性;2.PCOS患者与对照组人群中卵泡液MT水平与血清T、LH水平呈负相关,与FSH水平呈正相关;3.PCOS组人群卵泡液和卵巢颗粒细胞IL-6、IL-18与IL-8表达高于对照组水平,IL-10表达低于对照组水平;卵泡液MT水平与IL-18、IL-8水平呈负相关,与IL-10水平呈正相关;4.PCOS组人群卵巢颗粒细胞褪黑素受体MT1A表达高于对照组人群水平;5.PCOS组人群卵巢颗粒细胞雄激素受体AR和卵泡刺激素受体FSHR的表达高于对照组人群水平。结论PCOS患者与非PCOS人群中卵泡液MT的水平与血清性激素以及卵泡液炎症因子的表达存在相关性,提示卵泡液MT水平下降可能与PCOS卵巢功能紊乱有关。研究二褪黑素对青春期DHEA暴露致PCOS的保护机制研究目的1.从动物模型和细胞水平上分别探讨MT是否对DHEA诱导的PCOS具有保护作用;2.深入探讨MT对DHEA诱导的PCOS保护作用的可能机制。方法25日龄SD雌性大鼠,采用脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)(6mg/100g)连续背部皮下注射20天,建立PCOS模型大鼠;同时给予MT(50mg/kg/day)灌胃进行预处理;记录各造模组大鼠体重,观察MT对PCOS模型大鼠体重的影响;阴道涂片观察MT对PCOS模型大鼠动情周期的影响;收集血清,ELISA试剂盒检测MT对PCOS模型大鼠血清性激素和炎症因子水平的影响;获取卵巢组织,观察MT对PCOS模型大鼠卵巢大体形态与重量的影响,苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)观察各造模组大鼠卵巢组织形态学变化,免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)观察MT对PCOS模型大鼠卵巢炎症信号通路NFκB表达的影响,蛋白免疫印迹实验(Westernblot,WB)检测MT对PCOS模型大鼠卵巢炎症信号通路(NFκB、pIκB)、凋亡相关蛋白(Bcl2、BAX、Caspase3)、自噬相关蛋白(Beclin1、P62、LC3)及PI3K-AKT通路和褪黑素合成酶表达的影响。同时体外培养人卵巢颗粒细胞系KGN,用DHEA(100mM)诱导,分别给予MT(200mM)和联合给予MT与BEZ235(250nM)(PI3K-AKT通路抑制剂)预处理;采用流式细胞术和WB检测各组细胞凋亡情况;采用WB检测各组细胞自噬以及PI3K-AKT通路表达情况。结果1.MT预处理降低PCOS模型大鼠体重,差异无统计学意义;2.MT明显改善PCOS模型大鼠紊乱的动情周期,降低PCOS模型大鼠血清T、LH和LH/FSH比值,提示MT可以改善PCOS卵巢的内分泌功能;3.MT明显降低PCOS模型大鼠卵巢组织重量,卵巢外观和组织学结构接近正常组;4.MT明显降低PCOS模型大鼠血清IL-6和MIP-2水平以及卵巢组织NFκB表达,提示MT可以减轻PCOS的全身和卵巢局部炎症;5.PCOS模型大鼠卵巢组织自噬被激活,凋亡增加,MT明显降低自噬、凋亡,并激活PI3K-AKT通路;6.PCOS模型大鼠卵巢组织褪黑素合成酶表达减少,MT上调其表达;7.MT预处理降低DHEA诱导的KGN细胞自噬与凋亡,而这可以被PI3K-AKT通路抑制剂BEZ235所阻断。结论1.MT预处理可以改善PCOS模型大鼠的症状与卵巢功能;2.MT通过减轻炎症、抑制自噬以及减少凋亡,发挥对PCOS模型大鼠的保护作用;3.MT通过激活PI3K-AKT通路抑制自噬和凋亡,发挥对DHEA诱导的KGN细胞损伤的保护作用,这可能是MT保护PCOS卵巢功能的通路机制。总结论1.PCOS患者卵泡液MT水平下降,并与血清性激素以及卵泡液炎症因子的水平存在相关性,提示卵泡液MT水平下降可能与PCOS卵巢功能紊乱有关;2.MT通过减轻炎症、抑制自噬以及减少凋亡的作用,改善PCOS模型大鼠的症状与卵巢功能;3.MT通过激活PI3K-AKT通路抑制自噬和凋亡,这可能是MT对PCOS卵巢功能保护作用的通路机制。