尼克酰胺N-甲基化酶(NNMT,EC 2.1.1.1)是S—腺苷—L蛋氨酸(SAM)依赖的胞质酶,它以SAM为甲基供体,催化尼克酰胺和其他吡啶类物质形成吡啶盐类物质。据文献报道,NMMT酶蛋白含量和mRNA水平在多种疾病中的明显增高,例如肾癌、帕金森病、甲状腺癌等。在肾透明细胞癌中,NNMT基因表达是正常肾组织和其他亚型肾癌表达的三倍以上。在甲状腺癌中,几乎所有的乳头状甲状腺癌的NNMT蛋白及其mRNA水平都明显增高,但在滤泡状、未分化、髓样甲状腺癌中却不明显。在帕金森病人的脑脊液中,NNMT蛋白含量明显高于正常对照组。目前检测NNMT的方法主要有放射性同位素酶化学法,免疫印迹,PROTEOMEX分析,高密度寡核苷酸微阵法等。这些方法存在易污染或费用昂贵或同位素废物处理等缺点不适应用于临床诊断。本实验的目的在于构建NNMT的表达载体,表达正确的人NNMT蛋白,并制备其多克隆抗体,为下一步制备单克隆抗体及建立检测NNMT的ELISA法奠定基础。 目的 利用pGEX-4T-2系统构建重组尼克酰胺N-甲基化酶(NNMT)表达载体,诱导表达并对表达产物进行分离纯化,制备多克隆抗体及纯化抗体。 方法 根据NCBI核苷酸数据库编码为gi:12652950人NNMT cDNA序列,设计合成编码NNMT的DNA引物,并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点。从人肝脏组织中提取总RNA,进行RT-PCR获得NNMT基因。经T—A克隆至pGEM-T-Easy载体,经过BamHI/XhoI双酶切与同样经过双酶切的pGEX-4T-2连接。重组质粒pGEX-4T-2/NNMT转化至大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),重组菌经异丙基—β—D—硫代乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白GST-NNMT。通过DNA测序来证实质粒pGEX-4T-2/NNMT的正确性,SDS-PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。纯化后的融合蛋白作为抗原按常规方法免疫家兔,十周后收集兔血清,SAS沉淀法纯化IgG,用双向琼脂扩散和ELISA法测定多抗效价。