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背景:骨质疏松症是一种典型的老年性疾病,伴随着极高的发病率和死亡率并且显著的降低患者的生存质量,目前已经发展成为一个普遍的公众健康问题。骨质疏松症是以低骨量、骨组织微结构被破坏为特点的疾病,容易导致骨骼脆性增加并且诱发骨折。其诊断主要依靠骨密度检查,T值≤-2.5或者伴随脆性骨折即可确诊。在女性人群中,骨质疏松症和骨折的发生主要是由于绝经后雌激素水平的下降、破骨细胞参与的骨吸收和成骨细胞参与的骨形成之间的平衡被破坏以及骨量减少共同导致的。目前骨质疏松症的治疗方向主要集中在恢复和维持骨吸收和骨形成之间的平衡,临床上普遍采用药物治疗,包括抑制骨吸收药物和促进骨形成药物。除此之外,考虑到钙在骨代谢和骨平衡中发挥着重要作用,而且大部分女性的日常钙摄入量只有推荐摄入量的一半甚至更低,补充钙剂和维生素D也成为预防和治疗骨质疏松症的一个普遍方法,在临床治疗中广泛采用。近年来,越来越多的研究发现补钙并没有达到预期的治疗骨质疏松症和预防骨折的效果,不仅如此,还会引起心血管和胃肠道等系统的并发症,其潜在的具体原因和作用机制引发了更多的关注。近来有研究发现雌激素可以参与并调控部分钙通道的功能,我们推测绝经后妇女是否因为雌激素缺乏引起部分钙通道功能失调从而导致钙离子无法正常出入细胞发挥作用,因此影响补钙对骨质疏松症的预防和治疗效果。钙释放激活钙通道(Ca2+release activated Ca2+channel,CRAC)是最近发现的细胞受体依赖型钙离子内流钙通道,可以感受细胞内钙库钙释放而引起钙内流,STIM1和Orai1是其组成部分,分别位于内质网和质膜上,STIM1可以感受内质网钙库的释放并参与调控胞膜Orai1孔隙钙通道的开放。研究发现Orai1参与调控成骨细胞和破骨细胞的分化过程,而STIM1在其中的作用和具体功能还有待探索。本研究从绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞成骨分化能力和STIM1表达和功能的状态入手,深入探讨STIM1参与成骨分化的调控以及雌激素对STIM1的调控及其作用机制。该研究初步探索了钙释放激活钙通道和STIM1在成骨分化方面的作用和机制,进一步阐述了绝经后骨质疏松症发生发展的原因,开阔了临床中骨质疏松症治疗和预防的思路,提供了新的药物靶点和治疗策略。目的:阐明STIM1调控成骨细胞分化及参与绝经后骨质疏松症发生发展的机制方法:1.通过临床取材获得并培养绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞,加入成骨诱导液成骨诱导14天,检测成骨分化关键因子Alp、Ocn、Opn和Collagen1的转录水平及碱性磷酸酶活性和矿物沉积能力;检测STIM1表达与钙离子内流的变化,明确绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞STIM1表达、CRAC功能状态以及成骨分化能力有无异常。2.通过构建STIM1稳定knockdown细胞模型,在成骨诱导过程中检测成骨分化关键指标Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2、Osterix转录水平以及碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力,明确STIM1在成骨细胞成骨分化和骨形成中的作用。3.采用雌激素刺激小鼠成骨细胞系,检测STIM1蛋白表达与m RNA转录水平,明确雌激素和STIM1之间的联系;抑制PI3K-m TOR信号通路活性后,检测雌激素对STIM1表达的影响,进一步验证雌激素调控STIM1的具体机制和信号通路。4.通过对STIM1 knockdown细胞模型加入雌激素刺激,检测成骨诱导过程中成骨分化关键因子Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2、Osterix转录水平及碱性磷酸酶活性和胞外矿物沉积能力,明确STIM1是否参与雌激素调控的成骨细胞成骨分化过程。结果:1.我们通过临床手术获取绝经后骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞分离并培养,在成骨诱导过程中发现成骨分化关键指标Alp、Ocn、Opn和Collagen1转录水平以及碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力均下降,STIM1表达下降并且钙离子内流减少。提示绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞CRAC状态和功能异常,成骨分化能力降低。2.我们应用sh RNA干扰技术在小鼠MC3T3-E1细胞中成功构建STIM1稳定knockdown细胞模型,在成骨诱导过程中发现抑制STIM1的表达后,成骨分化关键指标Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2和Osterix转录水平及碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力均下降,提示STIM1可通过促进钙内流或其他方式进而促进成骨细胞的分化和功能。3.通过加入雌激素刺激小鼠成骨细胞系我们发现STIM1的蛋白表达与转录水平均升高;通过特异性抑制剂抑制特定信号通路PI3K-m TOR活性后,雌激素失去了对STIM1的上调作用,说明雌激素可以通过PI3K-m TOR信号通路上调STIM1的表达。4.通过构建小鼠MC3T3-E1细胞STIM1稳定knockdown细胞模型,我们发现抑制STIM1表达可明显阻断雌激素促进成骨分化关键指标Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2和Osterix转录及碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力的作用,提示STIM1参与雌激素调控的成骨分化和骨形成过程。结论:综上所述,我们的研究发现STIM1在成骨细胞的分化和功能中发挥重要作用,并且参与雌激素调控的成骨分化和骨形成过程。绝经后由于雌激素水平下降导致STIM1转录水平和表达下降,间接影响了钙释放激活钙通道的功能,降低了成骨细胞的成骨分化和骨形成能力,这可能是绝经后骨质疏松症的发生发展原因之一。该研究初步阐明了STIM1在成骨分化和骨形成方面的作用及其机制,可为进一步研究其信号通路和分子机制提供理论基础,并且为临床骨质疏松症的治疗提供新的策略和药物靶点。