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水稻是全世界最重要的粮食作物,但由灰飞虱以持久增殖型方式传播的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）严重危害水稻,并每年造成巨大的粮食产量损失。自噬作为一种先天性免疫在抵抗病毒入侵中发挥重要作用,而病毒在与寄主相互博弈过程中进化出逃避自噬或者抑制自噬机制而实现侵染,有些病毒甚至利用寄主的自噬体膜和自噬机制促进其繁殖、扩散。RBSDV侵染能否引起灰飞虱细胞自噬?灰飞虱细胞自噬反应对RBSDV复制和传播的作用是什么?RBSDV引起灰飞虱细胞自噬的分子机制是什么?这些科学问题亟待解答。为此,本论文分析了RBSDV侵染对传毒介体灰飞虱细胞自噬发生的影响,研究了RBSDV侵染诱导灰飞虱细胞自噬的分子机制及自噬对病毒侵染、复制的作用,取得如下研究结果:（1）RBSDV侵染诱导灰飞虱细胞自噬并抑制病毒侵染复制通过Western blot、电镜观察和组织免疫荧光技术发现,RBSDV饲毒后2-4 d,灰飞虱中肠细胞内ATG8-Ⅱ蛋白的积累量和自噬体数量明显增加,并且ATG8在细胞中的定位从弥散分布转变为点状聚集,表明在RBSDV侵染的早期可以诱导灰飞虱细胞发生自噬。为了明确自噬对RBSDV侵染和复制的作用,使用自噬抑制剂3-MA或自噬激活剂rapamycin处理灰飞虱24 h后进行饲毒,发现经3-MA处理的灰飞虱体内RBSDV P10的蛋白积累量和表达水平与DMSO对照相比明显提高,而经rapamycin处理的灰飞虱体内RBSDV P10的蛋白积累量和表达水平与DMSO对照相比显著降低。且沉默灰飞虱自噬相关基因ATG3、ATG5或ATG8后,灰飞虱的获毒率显著提高。以上结果表明,病毒侵染早期所引起的自噬可以抑制病毒的侵染和复制增殖。（2）RBSDV P10蛋白引起灰飞虱细胞和Sf9细胞自噬RBSDV共编码13个蛋白,为了探究病毒的哪个蛋白主要起到自噬诱导的作用,在Sf9细胞中利用杆状病毒表达体系分别表达了病毒的13个蛋白,通过Western blot和透射电子显微镜检测细胞自噬发生水平,发现表达RBSDV P10的Sf9细胞内ATG8-Ⅱ蛋白的积累量与自噬体的数量明显多于GFP对照。为了检测RBSDV P10蛋白是否可以引起灰飞虱细胞自噬,通过膜饲喂法饲喂灰飞虱原核表达的RBSDV P10重组蛋白,结果发现饲喂P10蛋白灰飞虱体内ATG8-Ⅱ的积累量明显高于饲喂GST蛋白对照,且在中肠细胞中也观察到更多的自噬体。表明RBSDV P10蛋白可以引起Sf9细胞和灰飞虱细胞自噬。（3）RBSDV P10与灰飞虱GAPDH互作并在中肠上皮细胞中共定位酵母双杂交实验筛选灰飞虱c DNA文库发现,灰飞虱GAPDH蛋白可以与RBSDV P10发生互作,并通过pull-down和Co-IP实验进一步证明了两者互作。为了观察RBSDV P10与GAPDH在中肠细胞中的定位,解剖饲毒后不同时间点灰飞虱中肠,利用荧光抗体分别标记P10与GAPDH蛋白,激光共聚焦显微镜观察发现,RBSDV P10蛋白与GAPDH蛋白在饲毒后4 d和7 d存在共定位,随后共定位逐渐减弱。且饲喂重组的RBSDV P10蛋白可以进入灰飞虱中肠细胞,同样观察到了RBSDV P10与GAPDH的共定位现象。（4）灰飞虱ATG3与GAPDH互作,但沉默GAPDH未影响自噬发生据报道,ATG3与GAPDH互作可以负调控本氏烟中的自噬。本论文的酵母双杂交实验、pull-down和Co-IP实验发现,灰飞虱的ATG3与GAPDH存在互作,但沉默GAPDH没有诱导灰飞虱或Sf9细胞的自噬,还抑制了RBSDV诱导的灰飞虱细胞自噬。说明GAPDH在昆虫细胞和植物细胞的自噬过程中所起的作用完全不同。（5）RBSDV P10促进AMPK和GAPDH磷酸化,磷酸化的GAPDH的核转位诱导细胞自噬有文献报道,当小鼠细胞在葡萄糖饥饿条件下GAPDH的第122位丝氨酸被AMPK磷酸化后进入细胞核,并与Sir1互作从而激活自噬。本研究的激光共聚焦显微镜观察和磷酸化分析实验等发现,糖饥饿处理后的Sf9细胞中GAPDH蛋白可以被AMPK磷酸化并进入细胞核中激发自噬,进一步研究发现灰飞虱GAPDH蛋白第95位丝氨酸是关键磷酸化位点。并发现表达RBSDV P10的Sf9细胞的GAPDH及RBSDV饲毒和重组RBSDV P10蛋白饲喂灰飞虱中肠细胞的GAPDH均可以进核诱导自噬。而且,表达RBSDV P10基因的Sf9细胞内的GAPDH和AMPK蛋白的磷酸化水平升高,饲毒灰飞虱中肠细胞内的AMPK蛋白的磷酸化水平也显著升高。沉默AMPK基因能抑制RBSDV P10所引起的GAPDH磷酸化和入核。此外,Co-IP实验证明AMPK与GAPDH互作,且磷酸化的AMPK能磷酸化GAPDH。综上所述,RBSDV P10蛋白或RBSDV侵染均能上调AMPK的磷酸化水平,从而导致其底物GAPDH磷酸化,磷酸化状态的GAPDH进入细胞核从而激活灰飞虱细胞的自噬途径,进而抑制RBSDV侵染和在灰飞虱体内的复制繁殖。