食管癌是指发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，是常见的恶性肿瘤之一。其发病年龄多在40岁以上，男性多于女性，但近年来其发病年龄有年轻化趋势。食管癌的发生涉及多种致病因子、多个阶段、多种基因变异的积累及相互作用，是一个复杂的过程；在分子水平上涉及多种原癌基因、抑癌基因以及蛋白质的改变；一些生长因子、受体、信号通路下游因子参与了食管癌的形成。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)是一种从牛脑提取的小分子胞质蛋白，属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族(phosphatidylethanolalmine-binding proteins, PEBPs)中的一个成员，该家族具有高度保守性，并且很少与其它蛋白家族具有同源性。RKIP广泛表达于人体多种组织及不同哺乳动物组织中，如猴子和鼠。RKIP可以抑制Raf介导的MAPK和ERK的活性，同时也可以抑制G蛋白偶联受体和NF-κB信号通路的活性。目前诸多研究显示RKIP表达减少可能会影响细胞生长、血管生成、凋亡及基因的完整性。RKIP作为一种肿瘤转移抑制蛋白，近期引起了国内外学者的广泛关注。在前列腺癌小鼠模型中，诱导RKIP表达可以阻止癌细胞向基底膜侵袭及转移，故可知其对前列腺癌细胞是一种转移抑制剂。在卵巢癌中RKIP既是转移抑制蛋白又可以抑制肿瘤生长，这是因为RKIP不但影响卵巢癌细胞的黏附和侵袭能力，而且影响肿瘤细胞的增殖。研究显示在大部分肿瘤中，如结直肠癌、胃癌、肝细胞癌及胃肠道间质瘤等，RKIP表达减少与肿瘤进展及患者预后均显示密切相关。尽管RKIP在肿瘤中的作用已经得到初步揭示，但是在食管癌中的作用却知之甚少。本实验旨在研究RKIP在食管癌组织中的表达、对食管癌细胞侵袭能力的影响及其分子生物学机制。本研究实验内容主要包括以下3部分。第一部分：RKIP在食管癌组织中的表达目的：研究RKIP在食管癌组织中的表达情况。方法：首先采用HE染色，在光学显微镜下观察食管癌组织病理情况，并进行组织病理学分型。Western blot及免疫组织化学染色方法测定40例食管癌患者的癌组织、癌旁组织(距病灶2cm)及正常食管组织(距病灶大于5cm)中RKIP的表达情况。采集患者临床和病理资料，通过统计分析观察RKIP的表达及其与临床和病理学参数的关系。结果：(1)通过对手术切除病理组织标本进行HE染色，确定了40例食管鳞状细胞癌。(2)免疫组织化学结果：RKIP在食管癌组织的表达明显低于癌旁组织及食管正常组织，RKIP在三者表达中的平均光密度值(mean density)分别为(0.0030.001，0.0280.003和0.0390.004)，P<0.05。但是癌旁组织与正常食管组织中RKIP表达无明显差异，P>0.05。根据RKIP光密度值和阳性细胞数进行综合分析，综合评分大于平均值的为RKIP阳性，综合评分低于平均值的为RKIP阴性，RKIP在癌组织、癌旁组织及正常组织中的阳性表达率分别为20%、55%和70%，卡方检验显示RKIP在食管癌组织中的表达明显低于正常食管上皮组织(P<0.05)。(3) Western blot分析结果显示：食管癌组织中RKIP表达(0.320.05)显著性低于癌旁组织(0.560.08)与正常组织(0.700.11)的表达(P<0.05)。进一步证明RKIP在食管癌组织中的表达明显减少。(4)临床与病理学参数分析：通过统计学分析发现RKIP在食管癌组织的低表达与淋巴结及远处转移有关，而与患者性别、年龄、肿瘤的分化程度和病理分级均无相关性。结论：食管鳞状细胞癌组织RKIP表达减少，RKIP低表达与患者淋巴结或远处转移有关。第二·部分：RKIP对食管癌细胞侵袭功能的影响目的：观察RKIP对食管癌细胞株TE的增殖、凋亡、黏附及侵袭能力的影响。方法：通过构建过表达RKIP及靶向RKIP的RNA干扰重组腺病毒感染TE细胞，应用MTT及BrdU标记法检测细胞增殖，应用流式细胞术、透射电镜及TUNEL检测细胞凋亡。通过Matrigel胶包被的24孔板检测细胞黏附功能，通过体外细胞侵袭实验检测TE细胞的侵袭能力。结果：(1) MTT结果显示，与无病毒干预的对照组比较，RKIP-RNAi-AD、NC-RNAi-GFP-AD、RKIP-AD及GFP-AD各组的细胞活力在不同时间点无差异。(2) BrdU检测结果显示，与无病毒干预的对照组相比，各组细胞增殖率无差异。(3) Annexin-V/PE联合标记流式细胞术检测结果显示，重组腺病毒转染TE细胞48h后，与无病毒干预的对照组相比，各组凋亡率均无差异。(4) TUNEL检测结果显示，在腺病毒感染TE细胞48h后，各组均未见明显凋亡细胞。(5)透射电镜结果显示，RKIP-AD组与无病毒干预的对照组均未见凋亡细胞。(6)细胞黏附实验显示，RKIP-AD组TE细胞的黏附率较GFP-AD组明显下降(64.60±13.67vs96.20±19.73, P<0.05); RKIP-RNAi-AD组较NC-RNAi-GFP-AD组细胞黏附率增加(174.80±22.67vs107.60±20.37,P<0.05);与无病毒干预的对照组相比，NC-RNAi-GFP-AD组及GFP-AD组TE细胞的黏附率均无差异(107.60±20.37,96.20±19.73vs98.60±19.31,P>0.05)。(7)细胞侵袭实验显示，与无病毒干预的对照组相比，GFP-AD组、NC-RNAi-GFP-AD组TE细胞侵袭力均无差异(80.25±10.87,67.75±13.30vs75.50±17.48, P>0.05)，RKIP-RNAi-AD与NC-RNAi-GFP-AD组相比，侵袭力明显增加(127.25±16.62vs67.75±13.30, P<0.05); RKIP-AD与GFP-AD组相比，侵袭力明显下降(9.50±7.14vs80.25±10.87, P<0.05)。结论：RKIP对食管癌细胞的增殖及凋亡无影响；RKIP抑制了食管癌细胞的侵袭及黏附能力。第三部分：RKIP抑制食管癌细胞侵袭的分子机制目的：探讨RKIP对食管癌细胞株TE侵袭能力影响的分子机制方法：通过Western blot技术分析RKIP、p-RKIP、ERK、p-ERK、Raf、p-Raf、GRK2及GAPDH蛋白的表达；通过real-time Q-PCR方法检测MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-14, Bcl-xL, Bcl-2, caspase-8,caspase-9, LIN28, TIMP-1, Elk, RKIP及GAPDH mRNA的表达。结果：(1) Western blot检测RKIP蛋白的表达情况，结果显示，与GFP-AD组相比，RKIP-AD组大量表达RKIP蛋白(2.31±0.36vs0.43±0.09)；与NC-RNAi-GFP-AD组相比，RKIP-RNAi-AD组RKIP表达下降(0.05±0.18vs0.38±0.08)；与无病毒干预的对照组相比，GFP-AD组及NC-RNAi-GFP-AD组均无差异。(2) Western blot检测Raf及ERK的磷酸化水平显示各组均未见差异。(3) Western blot检测GRK2蛋白的表达情况，结果显示，与GFP-AD组相比，RKIP-AD组GRK2蛋白的表达降低(0.52±0.10vs1.01±0.11)；与NC-RNAi-GFP-AD组相比，RKIP-RNAi-AD组GRK2表达升高(1.37±0.15vs0.84±0.10)；与无病毒干预的对照组相比，GFP-AD组及NC-RNAi-GFP-AD组均无差异。(4)应用实时荧光定量PCR，采用相对定量2-Ct法比较MMP-1,MMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-14, Bcl-xL, Bcl-2, caspase-8, caspase-9,TIMP-1, Elk, RKIP, LIN28及GAPDH mRNA在各组中的表达，结果显示，①与GFP-AD组相比， RKIP-AD组RKIP mRNA的表达明显增加(166.46±0.09vs1.00±0.00, P<0.05)。与NC-RKIP-RNAi-AD组相比，RKIP-RNAi-AD组RKIP mRNA表达明显下降(0.17±0.09vs1.00±0.00,P<0.05)。②与GFP-AD组相比，RKIP-AD组MMP-14mRNA的表达降低(0.26±0.20vs1.00±0.00, P<0.05)。与NC-RKIP-RNAi-AD组相比，RKIP-RNAi-AD组MMP-14mRNA表达增加(6.89±0.84vs1.00±0.00,P<0.05)。③与GFP-AD组相比， RKIP-AD组LIN28mRNA的表达降低(0.28±0.06vs1.00±0.00, P<0.05)。与NC-RKIP-RNAi-AD组相比，RKIP-RNAi-AD组LIN28mRNA表达增加(1.86±0.12vs1.00±0.00,P<0.05)。而MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-13, Bcl-xL, Bcl-2, caspase-8,caspase-9, TIMP-1, Elk mRNA表达在各组中均无显著性差异（P>0.05）。结论：在食管癌TE细胞中，RKIP对MAPK信号通路无影响，但参与了G蛋白偶联受体通路的调节；RKIP通过下调MMP-14及LIN28抑制了TE细胞的侵袭能力。