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研究背景与目的结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)为常见的消化道肿瘤,在全球每年约有100万新增病例及50万死亡病例。在我国,随人口老龄化及致癌因素的增加,CRC发病率呈逐年上升趋势。现如今,CRC难于早期诊断,其治疗以手术切除为主,转移和复发仍是导致CRC患者低生存率的主要原因。因此,阐明CRC发病的分子机制尤为重要,可为其早期诊断、治疗及预后等提供新的思路。B细胞淋巴瘤6B(B cell lymphoma 6 member B,BCL6B)基因位于人17号染色体短臂1区3带1亚带,属于B细胞淋巴瘤6(B cell lymphoma 6,BCL6)超家族成员,其广泛表达于人体正常组织,然而在多种肿瘤中则发生不同位点的缺失或突变;因启动子区DNA高甲基化导致的BCL6B表达缺失或下调普遍存在于胃癌、肝癌及CRC中,且其启动子甲基化程度与肿瘤的恶性程度及患者不良预后呈正相关;在CRC中,BCL6B的低表达与肿瘤TNM分期、淋巴转移及放化疗敏感性相关,增加CRC细胞系中BCL6B的表达可激活p53信号通路发挥抗CRC的作用。这些都提示BCL6B可能是一个抑癌基因。目前,关于BCL6B在肿瘤中的作用及机制的报道尚少。本研究拟检测和比较人正常肠上皮细胞系FHC及具有高转移潜能的CRC细胞系SW480和Lo Vo中BCL6B的表达水平,研究BCL6B对CRC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,并进一步探讨其相关分子机制,为阐明BCL6B在CRC发生发展中的作用和CRC发生发展的机制积累实验依据,也为CRC的诊治提供新的思路。方法1.人正常肠上皮细胞及人CRC细胞系中BCL6B内源性表达的检测:通过RT-PCR、q PCR和Western blot检测人正常肠上皮细胞系FHC及CRC细胞系SW480和Lo Vo中BCL6B的表达,比较癌细胞与正常细胞之间的表达差异。2.重组质粒pc DNA3.1-BCL6B和pc DNA3.1的扩增和验证:将携带人BCL6B基因编码序列的重组质粒pc DNA3.1-BCL6B及其对照质粒pc DNA3.1分别化转至感受态大肠杆菌DH5α中,在LB培养基中培养扩增后提取质粒,分光光度仪测定质粒的浓度,分装后于-20°C保存备用。将扩增所得pc DNA3.1-BCL6B转染SW480和Lo Vo细胞,经RT-PCR、q PCR和Western blot验证该质粒的转染效果。3.BCL6B对SW480和Lo Vo细胞增殖能力的影响:用pc DNA3.1-BCL6B转染SW480和Lo Vo细胞后,经MTT法和克隆形成试验检测其对细胞增殖能力的影响。4.BCL6B对SW480和Lo Vo细胞周期及凋亡的影响:用pc DNA3.1-BCL6B转染SW480和Lo Vo细胞后,经流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测和比较细胞周期及凋亡的变化。5.BCL6B对SW480和Lo Vo细胞迁移及侵袭能力的影响:用pc DNA3.1-BCL6B转染SW480和Lo Vo细胞后,经划痕愈合试验及Transwell试验分别检测其对细胞迁移及侵袭的影响。6.BCL6B对SW480和Lo Vo细胞中PI3K/AKT信号通路活性的影响:用pc DNA3.1-BCL6B处理SW480和Lo Vo细胞后,经Western blot检测细胞中p-AKT的蛋白水平;经RT-PCR和Western blot检测细胞中PI3K/AKT通路下游与细胞增殖及迁移相关靶基因Cyclin D1、E-cadherin和MMP-9的表达。7.PI3K/AKT信号通路在BCL6B诱导的CRC细胞增殖和迁移中的作用:联合应用pc DNA3.1-BCL6B和PI3K/AKT抑制剂LY294002处理Lo Vo细胞,经MTT法和Transwell试验分别检测细胞增殖和迁移能力的变化;同时,经Western blot检测Lo Vo细胞中Cyclin D1、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的变化。结果1.q RT-PCR结果显示FHC、SW480和Lo Vo细胞中BCL6B的m RNA相对表达量依次为0.93±0.60、0.04±0.05和0.06±0.04。Western blot结果显示这三株细胞中BCL6B蛋白的校正灰度值分别为0.74±0.20、0.06±0.04和0.10±0.03。即与人正常肠上皮细胞系FHC相比,BCL6B在人CRC细胞系SW480和Lo Vo中呈明显低表达。2.pc DNA3.1-BCL6B转染SW480和Lo Vo细胞48小时后,SW480细胞中BCL6B的m RNA和蛋白的相对灰度值分别是对照组的16.7倍(P<0.01)和10.5倍(P<0.01),Lo Vo细胞中BCL6B的m RNA和蛋白的相对灰度值分别是对照组的12.7倍(P<0.01)和7.3倍(P<0.05),提示:该重组质粒转染能够上调BCL6B在CRC细胞SW480和Lo Vo中的表达,可用于后续研究。3.BCL6B抑制SW480和Lo Vo细胞的增殖能力。1)MTT检测结果:BCL6B组SW480和Lo Vo细胞的OD值在1d及2d时与各自对照组的OD值之间无明显差异,在3d时则分别是对照组的65.6%(P<0.05)和70.7%(P<0.05),在4d时分别是对照组的61.2%(P<0.05)和52.7%(P<0.01)。2)克隆形成试验结果:BCL6B组SW480和Lo Vo细胞形成的克隆数分别是对照组的20.3%(P<0.01)和42.2%(P<0.05)。4.BCL6B可使SW480和Lo Vo细胞周期阻滞在G1期,且促进细胞凋亡。流式细胞术检测结果:BCL6B组SW480和Lo Vo细胞G1期细胞百分比分别为对照组的1.63倍(P<0.01)和1.67倍(P<0.01),S期细胞百分比分别为对照组的61.1%(P<0.01)和67.9%(P<0.05)。同时,与对照组相比,BCL6B组SW480和Lo Vo细胞的凋亡细胞数分别增加了的0.75倍(P<0.05)和2.12倍(P<0.01)。5.BCL6B抑制SW480和Lo Vo细胞的迁移和侵袭能力。1)划痕愈合试验结果显示,BCL6B组SW480和Lo Vo细胞48h划痕愈合率分别为对照组的61.1%(P<0.05)和55.6%(P<0.05),72h划痕愈合率分别为对照组的68.8%(P<0.05)和63.9%(P<0.05)。2)Transwell结果显示,质粒转染后48h,对照组SW480和Lo Vo细胞的穿膜细胞数分别为177±40和143±31,BCL6B组两种细胞的穿膜细胞数分别为69±37个和48±24,实验组穿膜细胞数明显低于对照组,差异具统计学显著性(P<0.05)。6.在pc DNA3.1-BCL6B转染的SW480和Lo Vo细胞中:1)p-AKT较对照组分别下调67.7%(P<0.05)和45.2%(P<0.05)。2)SW480细胞中PI3K/AKT通路下游与增殖和迁移相关的靶基因Cyclin D1、E-cadherin和MMP-9的m RNA水平分别为对照组的63.3%(P<0.05)、2.54倍(P<0.05)和29.4%(P<0.05),Lo Vo细胞中这三者的水平分别为对照组的32.2%(P<0.01)、3.32倍(P<0.05)和51.8%(P<0.05);3)与之一致的是,SW480细胞中Cyclin D1、E-cadherin和MMP-9的蛋白水平分别为对照组的54.4%(P<0.05)、2.05倍(P<0.05)和50.6%(P<0.05),Lo Vo细胞中三者的表达分别为对照组的18.9%(P<0.01)、2.04倍(P<0.05)和46.4%(P<0.01)。以上结果提示BCL6B可通过抑制SW480和Lo Vo细胞中PI3K/AKT通路活性,进而上调E-cadherin的表达和下调Cyclin D1和MMP-9的表达,从而实现其抑制CRC细胞增殖和迁移的作用。7.在Lo Vo细胞中,PI3K抑制剂LY294002显著增强了BCL6B对细胞增殖和迁移的抑制(MTT和Transwell,P<0.05),同时也增强BCL6B引起的Cyclin D1和MMP-9的下调和E-cadherin的上调(P<0.05)。提示PI3K/AKT信号通路的抑制参与介导BCL6B对CRC细胞增殖和迁移的抑制。结论1.BCL6B在人CRC细胞系SW480和Lo Vo中的表达明显低于人正常肠上皮细胞系FHC。2.BCL6B抑制SW480和Lo Vo细胞的增殖、迁移和侵袭,同时促进其凋亡。3.BCL6B抑制SW480和Lo Vo细胞中PI3K/AKT通路活性,并上调E-cadherin的表达和下调Cyclin D1和MMP-9的表达。4.PI3K/AKT通路的抑制参与介导BCL6B对Lo Vo细胞增殖和迁移的抑制及对Cyclin D1、E-cadherin和MMP-9表达的调节。