研究目的新生隐球菌是临床上最常见的侵袭性病原真菌之一,现如今隐球菌感染率逐年增加,即使应用指南推荐药物方案治疗,死亡率仍然保持在20%左右。第一部分研究中,从病原体与宿主相互作用角度综合探讨去泛素化酶Doa4对隐球菌的毒力的调控作用。第二部分研究中,根据前期实验结果,模拟隐球菌组织内感染状态,应用代谢组学,探索去泛素化酶Doa4缺失所影响非靶向代谢产物的差异,探究去泛素化酶Doa4所影响毒力的机制通路。第三部分研究中,拟通过体外棋盘法联合药敏实验测定粗糠柴苦素联合氟康唑抗隐球菌是否有增效作用。研究方法第一部分,通过同源重组原理以及基因敲除技术构建去泛素化酶Doa4基因突变株,结合体外表型、细胞和动物感染模型,探讨去泛素化酶Doa4对隐球菌的毒力的调控效用。第二部分,通过隐球菌分别在体外类组织培养液与常规培养液培养为对照,应用代谢组检测技术,从定性和半定量角度探索doa4Δ突变株的非靶向代谢产物的差异,并对突变株进行细胞壁荧光染色,观察去泛素化酶Doa4对于细胞壁以及荚膜上多糖物质结构的影响。第三部分,根据美国临床实验室标准化协会M27-A3指南,拟通过体外棋盘法联合药敏实验测定粗糠柴苦素联合氟康唑抗隐球菌是否有增效作用。研究结果第一部分,成功构建出去泛素化酶Doa4基因突变株和回复株,发现去泛素化酶Doa4参与隐球菌多种应激应答和毒力调控,巨噬细胞可以增强对突变株的的识别、吞噬和细胞内杀伤作用,并且可以调控隐球菌对血脑屏障模型的粘附与穿越;在动物感染实验中,突变株明显提升小鼠生存率,减少各器官菌荷量。第二部分,doa4?突变株在模拟组织培养时,与体外富营养状态下相比,胞内糖生化代谢以及细胞壁、荚膜的多糖的合成与组装代谢上存在明显差异。第三部分,粗糠柴苦素对37株隐球菌MIC值范围为32-256μg/ml,在与氟康唑联合作用时,FICI均≤0.50,使氟康唑的MIC值降低了2-16倍。结论一、去泛素化酶Doa4基因可能对于新生隐球菌的非经典毒力机制具有重要的调控作用。二、去泛素化酶Doa4基因在新生隐球菌肺部免疫适应与逃逸的过程中可能起着重要调节作用。三、去泛素化酶Doa4基因可能式通过改变胞内糖生化代谢和能量代谢以及细胞壁、荚膜的多糖的合成与组装代谢层面实现对于新生隐球菌毒力调控。四、粗糠柴苦素对隐球菌具有一定的抗真菌作用,同时与氟康唑联合使用能够发挥协同作用,提高氟康唑对隐球菌的敏感性。