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研究表明,牛卵巢上约99%的卵泡因闭锁退化而不能排卵,这是母牛繁殖效率低下和遗传资源浪费的主要原因。miRNA是一类转录后调控的非编码小分子,通常与靶基因3’-UTR区结合,引起靶基因降解或抑制mRNA翻译。研究表明,多种miRNAs调控细胞自噬,然而对于miRNAs如何调控牛卵巢颗粒细胞(BGCs)自噬的机制尚不清楚。本研究对不同直径牛卵泡中的颗粒细胞进行转录组测序,发现miR-21-3p在不同直径牛卵泡颗粒细胞中存在特异性表达。为了进一步解析miR-21-3p对牛卵巢颗粒细胞自噬的影响,本研究构建miR-21-3p类似物转染牛卵巢颗粒细胞,探究miR-21-3p在牛卵巢颗粒细胞自噬的调节机制。研究结果如下:1.取不同直径的牛卵泡中的颗粒细胞进行全转录组测序,分析在不同直径BGCs中自噬标志性基因的表达,结果表明自噬标志性基因LC3、BECN-1和ATG3均随着卵泡直径的增加表达量逐渐升高,P62的表达量则随着卵泡直径的增加逐渐降低;同时,我们对不同直径牛卵泡颗粒细胞中特异性表达与自噬相关的miRNAs进行筛选,发现miR-21-3p在不同直径BGCs中均有表达,且随着卵泡直径的增加,它的表达量逐渐降低。2.利用qRT-PCR及Western blot方法研究miR-21-3p对BGCs自噬的影响,结果表明,过表达miR-21-3p后,细胞自噬标记基因LC3、BECN-1、ATG3、ATG5和ATG7的m RNA表达水平及自噬标志蛋白LC3的表达量均显著低于对照组(P<0.05),P62的m RNA和蛋白表达水平则显著高于对照组(P<0.05),表明BGCs中miR-21-3p的过表达抑制了细胞自噬标志基因LC3、BECN-1、ATG3、ATG5和ATG7的表达;与NC组相比,inhibitor组LC3、BECN-1、ATG3、ATG5和ATG7的m RNA表达水平及自噬标志性蛋白LC3的表达量均显著高于对照组(P<0.05),P62的m RNA和蛋白表达水平则显著低于对照组(P<0.05),表明在BGCs中抑制miR-21-3p促进了细胞自噬标志基因LC3、BECN-1、ATG3、ATG5和ATG7的表达。3.利用RNAhybrid和Target Scan 7.1软件对miR-21-3p的靶基因进行预测,根据预测结果发现miR-21-3p靶向PI3K/AKT通路中关键基因VEGFA和FGF2。进一步在293T细胞中通过双荧光素报告验证miR-21-3p能够结合VEGFA 3’UTR和FGF2 3’UTR抑制报告基因表达;同时在BGCs中,qRT-PCR及Western blot结果表明miR-21-3p能够在转录后水平负调控VEGFA和FGF2,在翻译水平负调控VEGFA和FGF2蛋白的表达。4.挽救实验证明VEGFA和FGF2作为miR-21-3p下游功能性的直接靶点,影响BGCs自噬,研究结果显示,将miR-21-3p inhibitor和si-VEGFA、si-FGF2共转染入颗粒细胞后,可部分挽救miR-21-3p抑制BGCs自噬发生的现象。5.利用Western blot方法研究miR-21-3p通过靶向VEGFA、FGF2对自噬信号通路的影响,结果表明,过表达miR-21-3p后,AKT蛋白的磷酸化表达水平均显著低于对照组(P<0.05),表明过表达miR-21-3p通过降低BGCs中PI3K/AKT通路的磷酸化水平来抑制BGCs的自噬;与对照组相比,inhibitor组AKT蛋白的磷酸化表达水平均显著高于对照组(P<0.05),表明在BGCs中抑制miR-21-3p的表达,可以通过激活PI3K/AKT通路的磷酸化水平促进BGCs自噬。6.利用qRT-PCR及放射免疫法检测miR-21-3p对BGCs类固醇激素生成的影响。结果显示,转染miR-21-3p mimic显著增加培养液中E2的含量,而抑制miR-21-3p则可降低E2的产生;转染miR-21-3p mimic未能影响BGCs中细胞培养液P4的产生,但抑制miR-21-3p可显著增加培养液中P4的含量。同时,转染miR-21-3p mimic后BGCs中CYP19A1 mRNA的表达量显著升高,而转染miR-21-3p inhibitor后BGCs中CYP19A1mRNA的表达量显著降低。3βHSD的趋势则与CYP19A1表达趋势相同,但在抑制miR-21-3p后3βHSD的表达量无变化。综上所述,本研究证明了:(1)不同直径牛卵泡的颗粒细胞中,随卵泡直径增加,自噬现象越严重;(2)miR-21-3p可以调控BGCs自噬;(3)miR-21-3p通过靶向VEGFA、FGF2调控PI3K/Akt通路及类固醇激素生成,从而调节BGCs自噬的发生。本研究结果为探讨牛卵巢颗粒细胞自噬提供了一定的理论支持。