研究背景前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是男性患者中最常见的因实性器官恶性肿瘤和癌症而致死亡的第二个主要原因。根据长期大量的流行病学等研究,前列腺肿瘤的发生、发展主要受雄激素以及饮食习惯等综合因素的影响。而长期慢性炎症的刺激会导致人类罹患癌症的风险大大增加,患癌的风险比正常人增加约20%,这其中包括胃癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌。流行病学研究和组织病理学证据表明,PCa的发生率也与炎症相关,但是其具体的机制,至目前仍不完全被人类所认知。基本上,由慢性炎症最先创建一个环境,丰富的炎症反应可能会导致不受控制的细胞因子和生长因子增殖反应和快速分裂的基因突变的单元格。因此,PCa是与炎症密切相关特别是与炎症因子的作用。白细胞介素是人类体内广泛存在的炎症细胞因子,其种类繁多。而白细胞介素-6(IL-6)是一款多功能炎症因子。研究表明,细胞因子的表达及功能改变与人类的所患恶性肿瘤息息相关。白细胞介素-6也已被认定其在PCa患者的临床标本中表达和Pca细胞株中广泛存在。G蛋白偶联受体(GPCR)48,也被称为富含亮氨酸重复包含GPCR(LGR)4,其是一种糖蛋白激素受体,属于GPCR家族,并在其GPCR家族中扮演重要角色。一般情况下,LGR4将编码GPCR偶联蛋白之一。一项最近的研究发现白细胞介素-6增强LGR4蛋白在骨肉瘤细胞的表达,表明LGR4可能影响白细胞介素-6基因在肿瘤表达。此外,临床前和临床研究已经证实,GPCR在PCa组织组织中高表达。LGR4的表达与多种类型的癌症的发生相关,包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌,以及肝癌的形成。LGR4对肿瘤的影响已认识到,但目前却对LGR4表达的调节机制目前尚不清楚。小分子RNA(mi RNA)是一套内源性小非编码RNA(19-22碱基的长度)。和调节基因翻译、表达或裂解以及RNA序列的特异性相关。大量证据表明,mi RNA调节不同生物过程,包括细胞增殖、侵袭、迁移和细胞凋亡。mi RNA下调多个靶基因,包括原癌基因和抑癌基因,同时一些mi RNA功能作为肿瘤抑制因子和其他基因一起充当原癌基因。特别是,mi R-218,在有关mi RNA抑制肿瘤发展的研究中,其已被广泛认为与研究的几种类型癌症高度相关,在前列腺癌中同样存在。在本研究中,我们即是想探讨LGR4作为mi R-218的下位靶点,其是如何通过调控LGR4影响PCa细胞增殖和侵袭的。研究目的(一)分别采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测mi R-218和IL-6在癌旁正常组织(NP)、良性前列腺增生组(BPH)、前列腺癌组织的表达水平。(二)建立了一个在IL-6低浓度下长期孵育的LNCa P-IL-6细胞亚系,采用实时荧光定量PCR法检测mi R-218在LNCa P和LNCa P-IL-6细胞传代过程中的表达水平趋势。采用Brd U和Transwell法对IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6细胞系的影响进行统计分析。(三)采用Western blot analysis法检测IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6+细胞中对于LGR4蛋白表达的影响。材料与方法1.1病例选择:选取2012年7月至2015年7月在我院诊治的经确诊的58例前列腺癌患者的癌组织标本(Pca)、51例前列腺癌患者的癌旁正常组织标本(NP)、以及56例良性前列腺增生(BPH)患者的前列腺组织,同时均保存在-80℃冰箱内。所有患者均经入组标准筛选为确诊病例。1.2排除标准:已经接受了内分泌或其他治疗的患者被排除。1.3实验方法:分别采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测mi R-218和IL-6在癌旁正常组织(NP)、良性前列腺增生组(BPH)、前列腺癌组织(Pca)的表达水平;建立了一个在IL-6低浓度下长期孵育的LNCa P-IL-6细胞亚系,采用实时荧光定量PCR法检测mi R-218在LNCa P和LNCa P-IL-6细胞传代过程中的表达水平趋势;采用Brd U和Transwell法对IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6细胞系的影响进行统计分析;采用Western blot analysis检测IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6细胞中对于LGR4蛋白表达的影响。1.4统计学方法:定量资料采用统计学软件SPSS20.0进行统计分析,测定结果以x±s表示,对RT-PCR各组数据采用单因素方差分析,以P<0.05差异为有统计学意义。结果(一)mi R-218和IL-6在各组织中的表达水平1.mi R-218在癌旁正常组织(NP)、良性前列腺增殖组织(BPH)、前列腺癌组织(Pca)的表达水平依次降低,分别为(1.49±0.07)、(0.89±0.02)、(0.51±0.02),差异显著(P=0.012)、(P=0.024)、((P=0.001)具有统计学意义。2.IL-6在癌旁正常组织(NP)、良性前列腺增殖组织(BPH)、前列腺癌组织(Pca)的水平依次升高,分别为(1.09±0.05)、(1.89±0.01)、(2.52±0.02),差异显著(P=0.002)、(P=0.004)、((P=0.020)具有统计学意义。(二)在LNCa P-IL-6细胞亚系中,长期IL-6的刺激后,LNCa P细胞中mi R-218表达水平下降,结果说明mi R-218的表达在LNCa P转化为LNCa P-IL-6+细胞的过程中逐渐下降。(三)mi R-218阻碍IL-6诱导的LNCa P-IL-6细胞的增殖和侵袭。Brd U分析结果表明IL-6促进LNCa P-IL-6细胞增殖,然而mi R-218转染抑制了该作用。并且IL-6导致细胞周期中G0/G1期的细胞比例减少,相反mi-R218转染促进G0/G1期数目细胞的增加。Transwell的结果显示,LNCa P-IL-6细胞的侵袭能力在使用IL-6后显著升高,然而这一作用被mi R-218的转染显著抑制。(四)Western blot analysis法检测分别受到IL-6和mi R-218影响的LNCa P-IL-6+细胞中LGR4蛋白表达水平:LGR4在IL-6诱导的LNCa P-IL-6细胞中相对表达量为(2.20±0.30);LGR4在mi R-218诱导的LNCa P-IL-6细胞中相对表达量为(0.40±0.01);LGR4在IL-6+mi R-218诱导的LNCa P-IL-6细胞中相对表达量为(1.30±0.21);三者之间比较,差异均具有统计学意义。(五)RT-PCR法检测mi R-218在mi R-218转染后的LNCa P-IL-6+细胞系中的表达水平:在mi R-218转染组mi R-218的相对表达量为(1.20±0.20),与对照组相比显著增加,差异具有统计学意义。(六)Western blot analysis法LGR4蛋白在mi R-218转染后的LNCa P-IL-6+细胞系中的表达水平:在mi R-218转染组LGR4蛋白的相对表达量为(0.30±0.03),与对照组相比显著下降,差异具有统计学意义。结论(一)在前列腺癌的病程中mi R-218的表达下调,IL-6的表达上调。荧光定量PCR结果示:BPH患者mi R-218的表达较正常前列腺偏低,在前列腺癌患者的表达较BPH患者偏低。然而,ELISA结果显示IL-6水平在正常、BPH、前列腺癌患者中趋势与上述相反。长期IL-6的刺激后,LNCa P细胞中mi R-218表达水平下降,结果说明mi R-218的表达在正常前列腺、BPH、前列腺癌的进程中和LNCa P转化为LNCa P-IL-6细胞的过程中逐渐下降,而IL-6逐渐升高。(二)Mi R-218阻碍IL-6诱导的LNCa P-IL-6细胞的增殖和侵袭。Brd U分析结果表明IL-6促进LNCa P-IL-6细胞增殖,然而mi R-218转染抑制了该作用。统计分析表明IL-6导致细胞周期中G0/G1期的细胞比例减少,相反mi-R218转染促进G0/G1期数目细胞的增加,LNCa P-IL-6细胞的侵袭能力在使用IL-6后显著升高,然而这一作用被mi R-218的转染显著抑制。(三)Mi R-218抑制IL-6诱导的LNCa P-IL-6细胞中LGR4的表达。结果显示LGR4在LNCa P-IL-6细胞中经IL-6预处理后显著增加,然而mi R-218准然后完全抑制了以上变化(四)Mi R-218通过结合在LGR4 3’-UTR靶点发挥作用。生物信息预测显示在mi R-218和LGR4的3’-UTR之间存在一个可能的结合位点。为了证实这个靶点,我们进行了荧光素酶报告基因分析,去评估被MIR-LGR4-UTR质粒转染的HEK293T细胞的萤光素酶活性,并与转染对照质粒的细胞进行比较。结果显示mir-218显著抑制LGR4-wt的表达,然而LGR4-mut并无抑制效应。此外,荧光定量PCR结果证实了mi R-218转染促进了LNCa P-IL-6细胞中mi R-218的成熟。此外,LGR4蛋白水平在该过程中下降。总之,结果显示mi R-218直接作用于LNCa P-IL-6细胞中的LGR4位点。