心肌肥厚是心肌对做功增加的适应性反应,以心肌细胞体积增大和细胞外基质增多为特征。尽管心肌肥厚最初是一种代偿机制,但长期持续性的心肌肥厚能够引起扩张性心肌病、心力衰竭甚至猝死。虽然心肌肥厚首次被描述在一个多世纪以前,并且相关研究已经确定了一些介导心肌肥厚的信号通路,然而调节这些途径的机制尚未完全明确,目前临床上尚无十分有效的防治方法。因此,发现介导心肌肥厚的特异性分子及其相关信号通路,对于进一步阐明心肌肥厚的发生发展机制,寻找防治心肌肥厚的新靶点具有非常重要的理论和临床意义。caspase激活的DNA酶(CAD)亦称作DNA片断化裂解因子(DNA fragmentation factor, DFF40)、是caspase蛋白酶的主要效应器。CAD不仅在细胞凋亡诱导DNA片段化过程中发挥作用,而且还是诱导细胞分化的先决条件。CAD在功能上类似于其它核酸内切酶,如DNase Ⅰ, DNase Ⅱ和Endog,他们都在细胞凋亡和心肌肥厚过程中发挥重要作用。另外,CAD还与细胞增殖相关的几个转录因子具有相互作用,包括热休克蛋白70(Heat shock protein70, HSP70),热休克蛋白40(Heat shock protein40, HSP40)和高迁移率族蛋白(High mobility group box-1protein, HMGB1),这几个转录因子在心肌肥厚及心脏衰竭过程中都起着重要的作用,以上研究结果提示CAD可能在心肌肥厚及心衰过程中起着一定的作用。在本研究中,第一部分着重探讨CAD在病理性心肌肥厚的表达以及CAD在细胞水平上对心肌细胞肥大的影响。第二部分则主要利用CAD基因敲除小鼠和CAD心脏特异性转基因小鼠,用主动脉缩窄建立小鼠心肌肥厚模型,探讨CAD对心肌肥厚的作用。第三部分则通过体内和体外实验,探索CAD调节心肌肥厚的分子机制。第一部分CAD在病理性心肌肥厚中的表达水平及CAD在细胞水平上对心肌细胞肥大的影响目的：检测CAD在扩张型心肌病病人和小鼠心肌肥厚模型心肌组织中的表达水平,检测CAD在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)和去甲肾上腺素(PE)刺激的大鼠原代心肌细胞中的表达量变化,检测CAD在细胞水平上对心肌细胞肥大的影响。方法：选取扩张型心肌病病人的心肌组织和心脏正常捐献者的心肌组织进行Western blot检测(每组n=15)。选取8-10周龄,体重23.5-27.5g的野生型雄性C57BL/6小鼠为实验对象,通过主动脉缩窄(Aortic Banding, AB)建立压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型。将小鼠随机分为3组,分别为假手术组(sham)、主动脉缩窄术后4周组与8周组,收取心肌组织样品,进行Western blot检测(每组n=10)。在大鼠原代心肌细胞中,分别用PBS, AngⅡ和PE刺激细胞,48h后收取心肌细胞样品进行Western blot检测。在大鼠原代心肌细胞中,过表达或者干涉CAD的表达,然后用Angll刺激细胞,PBS作为对照组,48h后对心肌细胞样品进行免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测。结果：Western blot结果显示,与正常人心脏组织相比,扩张型心肌病病人心肌组织中CAD的蛋白表达水平下降,而心肌肥厚标志物肌球蛋白重链β(β-MHC)和心房钠尿肽(ANP)的蛋白表达水平出现明显的上升。在小鼠心肌肥厚模型中,小鼠心肌组织的CAD蛋白表达在主动脉缩窄术后4周出现明显下调,观察至8周始终维持在较低的表达水平上；与此同时,心肌肥厚标志物β-MHC和ANP的蛋白表达水平在主动脉缩窄术后持续维持在较高的表达水平。大鼠原代心肌细胞的CAD蛋白表达在AngⅡ和PE刺激后出现明显下调,而心肌肥厚标志物β-MHC和ANP的蛋白表达水平则出现了明显的上升。在原代培养的心肌细胞肥大模型中,降低CAD的表达量会减小心肌细胞肥大的程度：心肌细胞面积相对缩小,同时心肌肥大标志物(β-MHC和ANP)的表达水平也相应下降；相反的,增加CAD的表达量会加重心肌细胞肥大的程度,心肌细胞面积相对增大,而心肌肥大标志物的表达水平也随之上升。结论：扩张型心肌病病人的心肌组织中,CAD的蛋白表达水平明显下降。通过主动脉缩窄建立的小鼠心肌肥厚模型中,CAD的蛋白表达水平显著下调。AngⅡ和PE刺激的大鼠原代心肌细胞中,CAD的蛋白表达明显降低。在大鼠原代心肌细胞中,降低CAD的表达会减弱AngⅡ所导致的心肌肥大的程度,而CAD的表达增加会加重心肌肥大的程度。第二部分CAD在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚中的作用目的：利用CAD基因敲除小鼠,CAD心脏特异性转基因小鼠及对应的野生型小鼠,通过主动脉缩窄建立小鼠心肌肥厚模型,探讨CAD基因对压力超负荷诱导的心肌肥厚的作用。方法：选取8-10周龄、体重23.5-27.5g、雄性的野生型CAD基因敲除小鼠(sham, n=15; AB, n=20)、CAD心脏特异性转基因小鼠(sham, n=15; AB, n=20),以及各自的野生型C57BL/6对照小鼠(sham, n=15; AB, n=20),通过主动脉缩窄建立心肌肥厚模型,分为sham组与AB组。基因敲除小鼠于手术8周后,转基因小鼠小鼠在主动脉缩窄术4周后通过心脏超声、血流动力学进行心功能检测：比较各组小鼠的心重体重比、肺重体重比以及心重胫骨长比；通过大体拍照、苏木素伊红染色(HE)、麦胚凝集素荧光染色(WGA)以及天狼腥红染色(PSR)进行形态学检测;采用实时荧光定量PCR进行心肌肥厚与纤维化的分子标志物检测。结果：主动脉缩窄术后8周,CAD基因敲除小鼠的心重体重比、肺重体重比、心重胫骨长比、心肌细胞横截面积以及左室胶原容积分数明显低于野生型小鼠；心脏超声与血流动力学结果显示,CAD基因敲除小鼠左室舒张末期内径(LVEDD).左室收缩末期内径(LVESD)显著升高,而短轴缩短率(FS)显著下降；RT-PCR结果显示,CAD基因敲除小鼠心肌组织中ANP、B型利钠肽(BNP)与β-MHC等心肌肥厚标志物以及collagen Iα. collagen Ⅲα以及结缔组织生长因子(CTGF)等纤维化标志物的表达水平均低于野生型小鼠。与CAD基因敲除小鼠对心肌肥厚和纤维化的保护作用相反,CAD心脏特异性转基因小鼠在AB术后4周时,其心肌肥厚以及心脏纤维化的程度较野生型明显加重。结论：CAD基因敲除能够减轻压力负荷诱导的心肌肥厚与纤维化；而心脏特异性过表达CAD则加重了压力负荷诱导的心肌肥厚与纤维化。第三部分CAD在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚的作用机制研究目的：阐明CAD调控压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚的作用机制,为防治心肌肥厚提供新靶点和新策略。方法：选取8-10周龄、体重23.5-27.5g、雄性的野生型CAD基因敲除小鼠(sham, n=15; AB, n=20)、CAD心脏特异性转基因小鼠(sham, n=15; AB, n=20),以及各自的野生型C57BL/6对照小鼠(sham, n=15; AB, n=20),通过主动脉缩窄建立心肌肥厚模型,分为sham组与AB组。基因敲除小鼠于主动脉缩窄术后8周,转基因小鼠小鼠在主动脉缩窄术后4周分别通过Western blot检测各组小鼠心肌组织中丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)以及Smads等心肌肥厚相关的重要信号通路分子的磷酸化与总蛋白水平。以重组腺病毒载体AdCAD和AdshCAD感染原代心肌细胞,AdGFP和AdshRNA作为相应对照,通过AngⅡ刺激建立心肌细胞肥大模型,分为PBS组和AngⅡ刺激组。48h后通过Western blot检测各组小鼠心肌组织中MAPKs信号通路分子的磷酸化与总蛋白水平。通过转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)检测各组小鼠心肌细胞的凋亡情况,并且通过Western blot检测各组小鼠心肌组织中凋亡相关蛋白的表达水平。结果：通过Western blot方法,对各组小鼠心肌组织MAPKs信号通路分子的磷酸化与总蛋白水平进行检测,发现CAD基因敲除能够抑制压力负荷所激活的促丝裂原活化的蛋白激酶的激酶(MEK1/2)以及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)的表达,而对c-Jun氨基末端激酶(JNK1/2)和P38的表达没有影响；相反的,CAD心脏特异性转基因则能够进一步增强压力负荷所诱导的MEK1/2和ERK1/2的激活,而对JNK1/2和P38的表达同样没有影响。细胞实验的结果显示,CAD基因过表达和干涉对心肌细胞肥大的分子调控机制与CAD对小鼠心肌肥厚模型调控的分子机制是一致的。在CAD对心脏纤维化的作用机制研究中,我们的结果表明AB诱导的Smad2和Smad3磷酸化水平的升高以及核转位增多的程度在CAD基因敲除小鼠中明显被抑制,而CAD特异性转基因显著加强了AB诱导的Smad2和Smad3磷酸化水平的升高及其核转位的增加。在CAD对细胞凋亡的机制研究中,TUNEL结果显示,CAD基因敲除小鼠AB模型中的凋亡阳性细胞数明显下降,而CAD心脏特异性转基因小鼠AB模型的凋亡阳性细胞显著增加。Western blot结果显示,在AB模型中,活化的Caspase3及Bax的表达在CAD基因敲除小鼠中是下降的,在CAD心脏特异性转基因小鼠中是显著上升的;而Bcl-2的表达在CAD基因敲除小鼠中是显著上升的,在CAD心脏特异性转基因小鼠中是显著降低的。结论：CAD对压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚与纤维化的调控是通过对MEK1/2-ERK1/2、Smads以及细胞凋亡相关信号通路的调节来发挥作用的。