第一部分 HDM4及其剪切子HDM4-S在白血病中的表达　　 目的：探讨癌基因HDM4及其剪切子HDM4-S在急性髓性白血病(AML)以及慢性髓性白血病(CML)中的表达水平，并检测HDM4-S与 FL-HDM4 相对比值的变化，了解HDM4在白血病形成过程中的作用。　　 方法：用实时荧光聚合酶链反应(Real-Time PCR)方法检测了36例初治CML、35例AML患者以及15例正常人外周血单个核细胞中HDM4、HDM4-S的Mrna水平,采用2-△△Ct法处理实时荧光定量数据，分析白血病患者与正常人HDM4、HDM4-SMrna表达的变化；另外设计一对可以区分二者的引物，采用普通RT-PCR 方法同时扩增基因，根据琼脂糖凝胶电泳条带分析HDM4-S与 FL-HDM4 比例，并各组比较。　　 结果：(1) AML、CML 外周血单个核细胞中HDM4-S、HDM4 均表达， HDM4的表达水平均高于正常人的表达(p<0.05)，而HDM4-S的表达与正常人水平相比无明显变化(p>0.05)。(2)在正常人中，HDM4-S/ FL-HDM4 接近并小于等于1；在二种髓性白血病中，大多数还是以FL-HDM4为主，HDM4-S/ FL-HDM4 比例范围比较广；(3)某些白血病标本可见HDM4-S/ FL-HDM4 明显较大，CML中有8.57％ (3/35)、AML中有16.7％ (6/36)表现为HDM4-S/FL-HDM4>1。　　 结论：HDM4基因的高表达与髓性白血病的形成有关；虽然HDM-S的水平没有明显变化，与HDM4-S/FL-HDM4 比例的变化显著，可能与在白血病发生有关，在白血病的诊断中较单个剪切子的变化更有意义。　　 　　 目的：构建并鉴定真核表达载体Pegfp-C2-HDM2、Pegfp-C2-HDM4-S，并将重组质粒转染入人肝母细胞瘤细胞株HepG2、人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞中，筛选出阳性细胞克隆。　　 方法：应用分子克隆技术将HDM2、DM4-S全长Cdna 片段插入到真核表达载体Pegfp-C2，经双酶切、菌落PCR及测序鉴定，构建分别包含目的基因HDM2、HDM4-S的重组质粒Pegfp-C2-HDM2、Pegfp-C2-HDM4-S。利用脂质体介导Pegfp-C2-HDM2、Pegfp-C2-HDM4-S质粒分别转染到HepG2细胞、HUVEC细胞，荧光显微镜观察各组细胞的转染效率，并采用含G418的培养基筛选以获得稳定转染了HDM2、HDM4-S的阳性细胞克隆。　　 结果：(1)通过酶切、PCR鉴定、测序证实已经成功构建能够稳定表达和具有筛选特征的Pegfp-C2-HDM2、Pegfp-C2-HDM4-S 质粒载体。(2) 转染后经荧光显微镜检查可见Pegfp-C2-HDM2、Pegfp-C2-HDM4-S表达绿色荧光蛋白的阳性表达细胞，并采用G418 筛选获得了足够数量阳性克隆的含野生型HDM2、HDM4-S的转染细胞。　　 结论：成功构建真核表达载体Pegfp-C2-HDM2、Pegfp-C2-HDM4-S，通过G418筛选获得的阳性克隆细胞，可供后续研究使用。　　 　　 目的：探讨在HDM4不同剪切状态下，高表达外源性的HDM2、HDM4-S对其选择性剪切状态的影响，以及 HDM4-P53通路上的蛋白表达的变化。　　 方法：提取稳定转染了MDM2、HDM4-S的转染细胞进行RT-PCR和WB 反应，检测MDM2、HDM4-S 变化，以及通路中蛋白质的变化。　　 结果：在HepG2细胞模型中，高表达HDM2与高表达HDM4-S组中，FL-HDM4基因表达受到抑制，HDM4-S/FL-HDM4 比率显著增加；蛋白质表达情况：除了P21有明显改变，表现为依次增加趋势，P53和HDM4 没有很大变化。在HUVEC 模型中，HDM4基因表达也受到抑制，HDM4-S/FL-HDM4 比率也显著增加各组蛋白质表达情况变化更为明显，表现为：HDM4蛋白出现截短的异常剪接产物，但是在高表达HDM2和HDM4-S基因之间没有区别；P53水平依次降低；P21的水平依次增加。　　 讨论：在受外源性HDM2与HDM4-S 影响下，HDM4-S与FL-HDM4的比例均发生变化，而且在不同的细胞状态下反应性变化也不同，因此，HDM4 参与细胞稳态的维持，并且HDM4的选择性剪切子的变化是其机制之一。