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促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘脑分泌的一种肽类激素,与其相应受体结合后可以促进垂体合成和释放促性腺激素(gonadotropin hormone,GtH),GtH包括促黄体素(luteinizing hormone,LH)和促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH),对动物生殖具有非常重要的作用。在研究克隆了金钱鱼三种GnRH亚型(sbGnRH,c GnRH-Ⅱand sGnRH)的全长cDNA序列。采用RT-PCR的方法检测了GnRH在各个组织中的表达模式;应用荧光定量PCR技术检测了金钱鱼胚胎发育和性腺发育过程中GnRH的表达模式,同时检测了离体(0.1,1和10mM)和在体(0.001,0.01和0.1mg/g体重)条件下三种GnRH多肽对垂体FSH和LH mRNA表达的影响,以及雌二醇(E2)对下丘脑GnRH mRNA表达的影响。主要结果如下:主要的结果如下:1.金钱鱼促性腺激素释放激素基因克隆及序列分析金钱鱼三种GnRH亚型被克隆,其中sbGnRH的全长为334bp,开放阅读框为288bp,编码95个氨基酸;cGnRH-Ⅱ的全长为284bp,开放阅读框为258bp,编码85个氨基酸;sGnRH的全长为288bp,开放阅读框为273bp,编码90个氨基酸。三种GnRH氨基酸序列的同源性比对发现,金钱鱼cGnRH-Ⅱ是最保守的GnRH类型,s GnRH次之,sbGnRH最不保守。进化树分析发现,金钱鱼的三种GnRH的亲缘关系与鲈形目鱼类最近,与哺乳类最远。2.金钱鱼促性腺激素释放激素基因的时空表达模式在所检测的12种组织(垂体、胃、脑、卵巢、精巢、肾脏、肝脏、肠、脾、鳃、心和肌肉)中,sbGnRH在雌雄金钱鱼的所有组织中都表达,且表达量存在组织差异,而cGnRH-Ⅱ和s GnRH仅在雌雄金钱鱼的脑和性腺中表达,暗示sbGnRH、cGnRH-Ⅱ和sGnRH可能均与生殖调控密切相关,而sbGnRH可能发挥更为广泛的功能;在胚胎发育过程中,三种GnRH都在原肠胚期间高表达,并在原肠胚晚期达到峰值,而在其他胚胎发育时期则表达量很低,暗示着这三种GnRH可能都参与调控原肠胚的发生;在个体发育过程中,随着性腺的成熟,sbGnRH的表达逐渐升高,而c GnRH-Ⅱ和sGnRH的表达量无显著变化,暗示着在金钱鱼的性腺发育和生殖调控主要由sbGnRH来调控。3.GnRHs对FSH和LH mRNA表达的影响在体实验显示,金钱鱼腹腔注射不同剂量(0.001,0.01和0.1mg/g体重)的sbGnRH,3h和6h后,三种剂量的sbGnRH均可显著促进FSH m RNA的表达,低、中剂量(0.001,0.01mg/g体重)sbGnRH可促进LH mRNA的表达,但高剂量(0.1mg/g体重)sbGnRH处理对LH mRNA的表达无显著影响;低、中剂量sGnRH对FSH和LH mRNA表达无显著影响,而高剂量sGnRH可显著促进FSH(3,6h)和LH(3h)mRNA的表达,但对6h的LH mRNA表达无影响;与sGnRH作用类似,低、中剂量cGnRH-Ⅱ对FSH和LH mRNA表达无显著影响,处理3h后高剂量cGnRH-Ⅱ可显著促进FSH和LH mRNA的表达,但是处理6h后则没有影响。离体实验显示,以10μM sbGnRH离体孵育金钱鱼垂体,3h和6h后,FSH和LH mRNA的表达显著升高,但是0.1 and 1μM sbGnRH则对FSH和LH mRNA的表达没有影响。高浓度(10mM)sGnRH仅能在处理3h后显著促进FSH mRNA的表达,处理6h则不影响FSH mRNA的表达,sGnRH对LH mRNA的表达则始终没有影响。高浓度(10mM)cGnRH-Ⅱ仅能在处理6h后显著促进FSH m RNA的表达,处理3h则不影响FSH mRNA的表达,cGnRH-Ⅱ对LH mRNA的表达则始终没有影响。4.雌二醇对GnRH的反馈调节作用金钱鱼腹腔注射4mg/g体重E2,6h后,sbGnRH mRNA的表达显著降低,但cGnRH-Ⅱ和sGnRH的表达无显著变化;不同剂量的(0.1、1和10μM)E2离体孵育金钱鱼下丘脑3、6和12 h,各剂量雌二醇以明显剂量依存关系显著抑制sbGnRH mRNA的表达,但对cGnRH-Ⅱand s GnRH mRNA的表达无显著影响。雌激素受体广谱拮抗剂FULVESTRANT能明显促进下丘脑中sbGnRH mRNA的生成(P<0.05)。雌激素受体alpha型拮抗剂MPP也能在浓度为0.01和0.1μM时显著促进下丘脑中sbGnRH mRNA的产生(P<0.05),而在1μM时对sbGnRH m RNA的表达没有影响,雌激素受体beta型拮抗剂PHTPP能对下丘脑中sbGnRH mRNA的表达没有影响。说明当高浓度的E2可以显著抑制sbGnRH mRNA基因的表达,但是这种抑制作用可以被FULSTRANRT和MPP解除。研究结果表明,金钱鱼中GnRH至少存在三种亚型,即sbGnRH,cGnRH-Ⅱ和sGnRH,但在生殖调控中,sbGnRH发挥主要作用,E2对sbGnRH的抑制作用主要是通过雌激素受体alpha介导的。