越来越多的研究表明，人类的不良健康效应如激素依赖性肿瘤的发病率升高、免疫系统功能损伤、神经系统功能紊乱及生殖功能的异常可能与环境中的某些化学物质有关。由于这些化学物质能干扰内分泌功能，故也称环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors，EEDs)。EEDs的作用机制复杂，拟雌激素活性可能是其机制之一。有报道表明某些金属如镉、铅、有机锡具有内分泌干扰作用，而生产和生活环境中还广泛存在其它重金属如汞、锰、铬等，它们对人类和动物也有损害作用。这些损害作用是否也是通过内分泌干扰作用中的雌激素样作用，目前还没有确切证据。为此，本研究用MCF-7人类乳腺癌细胞增殖试验、去卵巢大鼠子宫增重试验、过氧化物酶活性测定试验和雌激素受体竞争结合试验来评价氯化汞、硫酸锰、氯化铬、三氧化铬的雌激素样作用，以初步探讨其内分泌干扰作用，为进一步研究其生殖和发育毒性作用机制提供实验依据。郑州人学医学院2003届硕士论文汞、铭和锰化合物雌激素样作用的实验研究方法 1.MCF一7人乳腺癌细胞增殖实验:用无酚红的RPMI一1640培养基(内含活性炭一葡聚糖处理的10%胎牛血清，30U/100ml胰岛素)调整细胞浓度为20000一30000/ml，接种于96孔培养板，每孔接种100 pl。贴壁培养24h后，弃培养液，加入200 pl含有不同剂量受试物、溶剂对照以及阳性物的不含酚红的RPMI一1 640培养基。各剂量均设6个平行孔，每3d换一次液，培养6d后弃上清，每孔加入曝哇兰(MTT)25 pl，放置在培养箱中，4h后，弃孔内液体，每孔加入二甲基亚矾(DMSO)1 50 pl。振荡10min后，用酶联免疫检测仪于490川。波长处测定吸光值。 2.子宫增重试验:大鼠行双侧去卵巢手术后，于第16d随机分5组，每组8只，分别为阴性对照组(蒸馏水)，低、中、高剂量氯化汞组o.04mg/kg、0.20mg/kg、1.00mg/kg，阳性对照组雌二醇10009/kg，以花生油为溶剂，给药容积为2.oml/kg体重，每天腹腔注射一次，连续3d。最后一次给药后24h，称重，颈椎脱臼处死大鼠，迅速取出子宫，剔除周围结缔组织和脂肪，吸干子宫表面血渍和一了宫内液，于万分之一天平上称量。 3.过氧化物酶活性测定:将子宫剪碎后，按1:20( mg/n 11)]J11预冷的5%caclZ溶液，冰浴中用玻璃匀浆器匀浆，于4℃，12000rpm离心20min，上清液用愈创木酚比色法测定过氧化物酶活性。 4.大鼠子宫雌激素受体竞争结合试验:性成熟雌性SD大鼠颈椎脱自处死后，剥离子宫，预冷生理盐水冲洗，称重，计算所需组织抽提液的体积，剪碎，加入1:6(mg/ml)预冷的抽提缓冲液，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，于150oorpm，4℃离心3omin，上清液即为胞浆液。用考马斯亮蓝G一250/BsA法测定胞浆液中蛋白含量:体外雌激素受体竞争结合实验参考朱国璋方法:多点饱郑州少、学医学院2003届硕卜论文汞、铭和锰化合物雌激素样作用的实验研究和分析时，总结合反应(total binding，TB)管中加入不同浓度的3H一EZ，分别为0.snlnol/L、Inmol/L、Zn:1101/L、4nmol/L、sn，nol/L。根据Seatehard图，采用10，lmol/L作单点饱和分析。葡聚糖一活性炭(Dcc)法分离游离的和结合的3H一E:后，将上清液倒入sml的闪烁液中，用FJ一2101G双道液休闪烁计数器计数。结果 1.l0’’Zmol/L雌二醇即可诱导MCF一7细胞增殖，增殖量为阴性对照的1.28倍;10一”mol/L雌二醇使MCF一7人乳腺癌细胞增殖达最大，是阴性对照的4.48倍。氯化汞对MCF一7人乳腺癌细胞增殖效应与雌二醇相似，表现出剂量一效应关系，10一7mol/L氯化汞使McF一7人乳腺癌细胞增殖达最大，为阴性对照的3.08倍，氯化汞的相对增殖效率为雌二醇的59.8%，相对增殖能力为0.01。在预实验中氯化汞在一。一3 molzL一1寸，细胞全部l匕现死z兰:一。一4 1110一/L”寸，到l!)j包大部分出现死亡。当用10一6 mol/L雌激素拮抗剂}C!182.780处理时，能完全阻断雌二醇和氯化汞所引起的细胞增殖。但不同剂量硫酸锰、氯化铬、三氧化铬对MCF一7细胞增殖作用不明显。 2.在成年去卵巢大鼠子宫增重试验中，随着给予氯化汞剂量的增加，子宫湿重增加，呈剂量一效应关系，经单因素方差分析，仅高剂量组与阴性对一照组比较有统计学意义(P<0.05)。 3.氯化汞可引起子宫过氧化物酶活性增加，且呈剂量一效应关系，经单因素方差分析，仅高剂量组与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。 4.氯化汞、硫酸锰、氯化铬、三氧化铬均表现出随浓度的增高，与大鼠胞浆ER结合的3H一E:量并没有明显降低。结论 氯化汞在体外实验中能诱导MC卜7细胞增殖;在体内实验中能诱导子宫重郑州人学医学院2003届硕士论文汞、铬和锰化合物雌激素样作用的实验研究量增加和过氧化物酶活性增高;但在受体竞争结合实验中不能与3H一E:竞争结合ER，提示氯化汞具有雌激素样作用。硫酸锰、氯化铬、三氧化铬在2种体外实验中不显示雌激素样作用。