论文部分内容阅读
1.目的自从证实拟钉螺可作为湄公血吸虫病、中华血吸虫病和狸殖吸虫病的传播媒介以来,拟钉螺在医学上的重要性被人们所重视,且近年来我国东南沿海及内地的部分省市并殖吸虫病有此起彼伏﹑散在发生的趋势,作为狸殖吸虫的第一中间宿主,拟钉螺的分类研究既有生物学上的理论价值,又有医学上的实用价值。至今,有报道在亚洲发现属于拟钉螺亚科的种类已逾100种,以我国为最多﹑分布最广的国家,我国以往对拟钉螺的研究多限于传统方法,在拟钉螺的分类研究中存在如种名错定、同种异名等诸多问题。近年来分子生物学的发展为物种鉴定开辟了一条新路,本研究选用了RAPD技术对我国湖北、福建和广西3省5地的6种拟钉螺进行基因水平的研究,以了解其基因组DNA的多态性差异,并构建系统进化树。此外,形态学及地理生态环境比较一直是对螺种进行鉴定的基本方法,也是进行其它研究的基础,所以本研究还将RAPD分类结果与6种拟钉螺的外部形态和生态环境进行了综合分析和初步探讨。2.方法收集我国广西省武鸣县、福建省福州市新店以及湖北省五峰县沈家堡、十堰市许家沟、钟祥市客店3省5地的6种拟钉螺。其中福建新店,五峰沈家堡,钟祥客店的拟钉螺已有文献记载,分别命名为新店拟钉螺(T. xindiangensis),秉氏拟钉螺(T. pingi),向氏拟钉螺(T. hsiangi),洪山拟钉螺(T. hongshanensis)。广西武鸣,湖北十堰的拟钉螺暂以地名命名为武鸣拟钉螺和十堰拟钉螺。1.肉眼和体视显微镜系统观察拟钉螺的外部形态并记录,了解其生态环境;2.常规高盐法抽提上述拟钉螺的基因组DNA,采用RAPD技术对其进行PCR扩增,以方格短沟蜷作为种外对照。根据RAPD扩增的结果,计算各拟钉螺种间的遗传距离和相似系数,根据各分子标记的迁移率及其有或无,统计得所有位点的二元数据,采用SPSS11.0软件的Between-groups linkage法对所得二元数据进行聚类分析,绘制系统进化树。3.结果①6种拟钉螺形态特征观察及栖息环境的比较结果:秉氏拟钉螺和向氏拟钉螺均采自湖北五峰县沈家堡,两者的生态环境完全相同,外部形态上相似处颇多。洪山拟钉螺与新店拟钉螺在外部形态和生态环境方面较为相似。而其它螺种间则相对差异较大。②DNA提取: DNA溶液A260/A280值经测定在1.60～2.00之间,纯度符合要求。③RAPD:1)种外差异6条引物对拟钉螺与方格短沟蜷的DNA扩增的条带共计87条,对应基因组中的87个位点,其中拟钉螺的条带71条,方格短沟蜷14条;两者间相同条带为5条,相似系数为0.339,遗传距离大于0.66。2)种间差异本实验拟钉螺种间遗传距离在0.1301～0.3151间,平均值为0.2248,其中秉氏拟钉螺和向氏拟钉螺的扩增带型具有较大相似性,相似系数为0.8699,遗传距离仅为0.1301;新店拟钉螺与洪山拟钉螺的扩增带型具有较大相似性,相似系数为0.8558,遗传距离仅为0.1442,此两种与十堰拟钉螺扩增条带又具有一定相似性;而武鸣拟钉螺与其它螺种间则差异较显著,遗传距离为0.2234～0.3151。3)系统进化树在SPSS构建的系统进化树中6种拟钉螺被分为4类:①秉氏拟钉螺和向氏拟钉螺;②洪山拟钉螺和新店拟钉螺;③十堰拟钉螺;④武鸣拟钉螺。4.结论根据RAPD的实验结果,3省5地的6种拟钉螺在基因水平分为4类:①秉氏拟钉螺和向氏拟钉螺;②洪山拟钉螺和新店拟钉螺;③十堰拟钉螺;④武鸣拟钉螺。6种拟钉螺在基因水平上存在差异。结合外部形态和生态环境的观察比较结果发现,此DNA水平的差异与拟钉螺外部形态、生态因素上的差异存在一定关联。本实验首次将分子生物学水平的RAPD技术应用于对拟钉螺的遗传变异的研究,认为RAPD技术能有效的区分拟钉螺种间的差异,用于拟钉螺研究是行之有效的一种方法。