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背景:肿瘤患者血液和组织中的亚硝酸盐水平普遍高于正常水平。而且亚硝酸盐在一定浓度下促进肿瘤生长,但是迄今为止,亚硝酸盐促进肿瘤生长的具体机制尚不完全清楚。有研究认为亚硝酸盐以亚硝酸根离子(NO2-)的形式存在于体内,NO2-可能通过直接抑制线粒体呼吸链复合物,并导致超氧阴离子(O2·-)的增加。亚硝酸盐还可以通过还原为一氧化氮(Nitric oxide,NO),NO可以与O2·-快速相互作用,生成过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)等其他活性氧(Reactive oxygen species,ROS),所以亚硝酸盐可能增加肿瘤细胞细胞内的ROS水平。另外,核因子E2相关因子-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2)是细胞抗氧化反应的主要调控因子,当细胞内的ROS过量产生可以促进Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)上半胱氨酸残基的氧化,抑制Nrf2的降解,促使Nrf2向细胞核中转移,以增加Nrf2的激活。此外,越来越多的证据研究表明对于机体内已经存在的肿瘤,Nrf2的激活有助于肿瘤细胞的增殖及其恶性进展。目的:本研究旨在探讨亚硝酸盐对人肝癌SMMC-7721细胞内ROS水平的影响,以及亚硝酸盐对人肝癌SMMC-7721细胞促进作用与Nrf2激活之间的关系。方法:本实验采用了RNA干扰技术,用Nrf2 si RNA干扰人肝癌SMMC-7721细胞,RT-PCR和Western Blot法检测细胞内Nrf2的m RNA水平和蛋白水平的变化;采用DCFH-DA染色细胞后通过荧光显微镜观察和流式细胞术检测SMMC-7721细胞内ROS含量的变化;采用NO检测试剂盒检测SMMC-7721细胞内NO含量的变化;用总抗氧化能力检测试剂盒检测SMMC-7721细胞的总抗氧化能力的变化;用Western Blot法检测人肝癌SMMC-7721细胞的细胞质和细胞核中Nrf2蛋白表达改变;体外克隆形成实验检测SMMC-7721细胞增殖能力变化;MTT法检测SMMC-7721细胞生存率的变化;DAPI染色观察SMMC-7721细胞细胞核形态的改变;Annexin V-FITC/PI双染法检测SMMC-7721细胞的细胞凋亡率变化;检测细胞微丝的分布观察SMMC-7721细胞的运动能力的改变;用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力变化。结果:(1)用Nrf2 si RNA干扰人肝癌SMMC-7721细胞后,RT-PCR检测结果显示SMMC-7721细胞内的Nrf2 m RNA显著减少,同时Western Blot结果表明SMMC-7721细胞的细胞质和细胞核中Nrf2蛋白表达量均明显下降。反映SMMC-7721细胞内的Nrf2被稳定下调。(2)用DCFH-DA染色法检测SMMC-7721细胞内ROS含量,结果表明亚硝酸盐(SN:16mg/L)增加SMMC-7721细胞内活性氧水平;当用Nrf2 si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,细胞内的ROS水平被明显增高。(3)Western Blot结果显示亚硝酸盐增加SMMC-7721细胞细胞核内Nrf2蛋白的积累;但是,当Nrf2si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,细胞核内Nrf2蛋白明显减少。检测细胞总抗氧化能力结果表明亚硝酸盐明显增强SMMC-7721细胞的总抗氧化能力,但是,当Nrf2 si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,细胞总抗氧化能力明显下降。(4)细胞克隆实验结果表明亚硝酸盐明显增加细胞克隆数,但是,当Nrf2 si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,细胞克隆数明显减少。同时MTT法检测细胞生存能力结果显示亚硝酸盐增强SMMC-7721细胞生存率,但是,当Nrf2 si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,细胞生存率显著下降。(5)用DAPI染色观察细胞核形态的变化,结果显示亚硝酸盐处理SMMC-7721细胞,细胞核没有明显改变。但是,当Nrf2 si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,此时细胞核出现染色质凝集和核固缩等凋亡的特征性改变。同样,用Annexin V-FITC/PI双染法检测SMMC-7721细胞的凋亡率,Nrf2 si RNA+亚硝酸盐组细胞的凋亡率明显增加;(6)通过微丝分布检测细胞的运动能力,检测结果显示亚硝酸盐处理SMMC-7721细胞后,梭形细胞增多,应力纤维和伪足增加,细胞运动能力增加;但是,当Nrf2 si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,细胞的皮质层明显变厚,应力纤维减少甚至消失。Transwell检测细胞迁移和侵袭实验结果显示亚硝酸盐明显增强SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力,但是,当Nrf2 si RNA干扰SMMC-7721细胞后,再用亚硝酸盐处理缺失Nrf2的SMMC-7721细胞,SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力均显著减弱。结论:亚硝酸盐(16mg/L)增加了人肝癌SMMC-7721细胞内的ROS水平,通过激活Nrf2进而促进人肝癌SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭能力。