研究背景胃癌是东亚地区尤其高发的恶性肿瘤,全球近一半胃癌患者位于中国。由于胃癌初期症状隐匿,在中国80%的胃癌患者初诊即处于进展期。对于不可切除胃癌,化疗是系统治疗的基石,但有限的疗效以及明显的不良反应限制了患者的生存获益,中位生存期不足1年,5年生存率低于30%。随着肿瘤分子生物学的发展,靶向治疗走上恶性肿瘤治疗的舞台。2010年ToGA研究结果首次表明靶向HER2的曲妥珠单抗联合化疗(顺铂联合氟尿嘧啶或改良方案)对比单纯化疗中位生存期可延长近6个月(NCT01041404),开启了胃癌靶向治疗时代。但是,尚无针对其他靶点如VEGF、MET、EGFR的靶向药物在不可切除胃癌的一线临床研究中取得成功:曲妥珠单抗在胃癌一线治疗中具有独一无二的地位。然而,一线治疗1年左右出现的继发耐药往往难以避免,而且在HER2阳性乳腺癌中被批准可跨线使用的曲妥珠单抗在HER2阳性胃癌跨线治疗研究中以失败告终,这使得后ToGA时代的HER2阳性胃癌病人亟待新的治疗方案。但是,目前已经进行的针对一线治疗进展后HER2阳性胃癌患者的临床试验仍未获得阳性结果。在HTER2阳性乳腺癌中成功的拉帕替尼(Lapatinib)及曲妥珠单抗-美登素耦合物(Trastuzumab emtansine,T-DM1),在HER2阳性胃癌的二线治疗中均被证实不能产生更多生存获益。且NCCN(National Comprehensive Cancer Network)胃癌指南中也未区分HER2阳性或阴性患者的二线化疗方案。综上,目前针对一线曲妥珠单抗联合化疗治疗进展的患者并没有针对性的治疗策略,临床上对这部分患者与HER2阴性患者一样采用胃癌二线化疗方案,且最为推荐的两个方案:单药紫杉类药物及单药伊立替康在所有胃癌二线治疗中疗效相近。HER2阳性胃癌发生曲妥珠单抗耐药后对二线化疗药物的敏感性是否发生改变,目前未见研究。所以,对于一线治疗进展后的HER2阳性胃癌患者,其化疗药物及靶向药物的选择仍未有突破。一方面,曲妥珠单抗耐药若对胃癌的化疗药物敏感性存在影响,则对于HER2阳性胃癌患者的二线治疗方案的制定有重大指导意义;另一方面,上述探索HER2阳性胃癌二线治疗方案的临床试验,均选择紫杉类药物作为基础用药或对比基线,曲妥珠单抗耐药对紫杉类药物敏感性的影响会直接影响上述临床实验的结果。更重要的是,若曲妥珠单抗耐药会导致HER2阳性胃癌对化疗药物敏感性也发生改变,这提示靶向药物与化疗药物敏感性可能存在相互关系,值得深入探讨不同癌种不同靶向药物与化疗药物的使用配伍或顺序。既往在雌激素阳性的乳腺癌研究中发现内分泌治疗药物他莫昔芬耐药会导致DNA损伤类化疗药物耐药,这提示其他类别的肿瘤治疗药物耐药可能导致化疗耐药。因此,本研究探索了HER2阳性胃癌中,曲妥珠单抗耐药对比野生型是否存在化疗药物,尤其是紫杉类药物的敏感性差异。这将为后ToGA时代的新方案的探索做铺垫。接下来,我们对HER2阳性胃癌中曲妥珠单抗耐药伴随发生化疗敏感性下降的机制进行探讨。由于曲妥珠单抗耐药胃癌同时对多种结构不同的化疗药物耐受,我们首先考虑介导多药耐药(Multidrug resistance,MDR)最为经典的ABC家族(ATP-binding cassette transporters,ABC)表达改变可能是曲妥珠单抗耐药胃癌发生多种化疗药物敏感性下降的原因。进一步地,我们探索同时介导曲妥珠单抗耐药与ABCB1表达上调的机制。膜胆固醇是调控ABC家族转运活性的重要因素,同时在HER2阳性曲妥珠单抗耐药胃癌细胞中胆固醇稳态通路上调,既往研究发现耗竭HER2阳性胃癌细胞的膜胆固醇,可增加其对曲妥珠单抗的敏感性。使用Gene Ontology通路富集分析GSE77346芯片可见NCI-N87细胞的曲妥珠单抗耐药株对比野生株差异基因富集至膜脂质代谢及蛋白质膜定位相关通路,也提示耐药株膜蛋白定位可能因膜脂质代谢上调而改变。所以,我们筛选了耐药株中上调的ABC家族成员,同时对耐药株的胆固醇的分布特征进行了检测,并对ABCB1或膜胆固醇进行干预以检测两者是否影响化疗药物敏感性以及膜胆固醇对ABCB1表达是否存在调控关系。最后我们对耐药细胞中膜胆固醇的增加上调ABCB1表达降低紫杉类药物敏感性的机制进行进一步探究。首先,膜胆固醇可以直接作为配体激活Hedgehog(Hh)通路,而在Hh通路激活后,GLI1入核可以促进ABCB1转录。另外,膜胆固醇也可直接改变膜上脂筏结构从而影响膜蛋白表达。膜胆固醇增加导致膜流动性下降,小窝脂筏及其标志CAV1在膜上的表达会增加。而CAV1参与调控蛋白转运与降解,如在NCI-N87细胞中,CAV1可降低HER2蛋白稳定性,降低膜CAV1可增加NCI-N87细胞的曲妥珠单抗敏感性;NCI-N87的T-DM1耐药株中,CAV1介导T-DM1内吞至溶酶体途径降解。而CAV1与ABCB1结合可抑制ABCB1的泵活性,CAV1表达可通过抑制自噬抑制ABC家族溶酶体途径降解。由此,我们尝试从Hh通路及CAV1调控两个途径,以ABCB1转录及蛋白稳定性两个角度解释耐药细胞中膜胆固醇通过上调ABCB1介导紫杉类药物敏感性下降的原因。研究方法和结果1.曲妥珠单抗耐药胃癌对多种化疗药物敏感性下降筛选人源性胃癌细胞中HER2基因扩增的两株细胞:NCI-N87及SNU-216,通过3D-2D转换模型持续曲妥珠单抗刺激,构建曲妥珠单抗耐药细胞模型。经细胞活性检测、平板克隆形成及流式细胞术检测凋亡细胞,3项实验验证曲妥珠单抗耐药细胞的耐药性。确定耐药株构建成功后,选择细胞活性检测、平板克隆形成及流式细胞术3项试验,检测野生细胞及耐药细胞对胃癌常用化疗药物奥沙利铂(Oxaliplatin,OX)、顺铂(Cisplatin,DDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、紫杉醇(Paclitaxel,PTX)、多西他赛(Doxetaxel,DTX)的敏感性改变。发现曲妥珠单抗耐药细胞对OX呈现明显耐药现象,对PTX及DTX的敏感性亦下降。在确定细胞水平的变化后,我们选取NCI-N87的野生细胞和耐药细胞,在裸鼠左右对称部位构建皮下瘤模型,予生理盐水、曲妥珠单抗、FOLFOX(包含5-FU、叶酸(leucovorin)及OX)、PTX治疗,可见在PTX组仍然存在耐药肿瘤瘤体大于野生肿瘤瘤体现象,这与细胞水平研究结果一致。综上证明,HER2阳性曲妥珠单抗耐药胃癌对多种化疗药物敏感性下降。2.富集的膜胆固醇上调ABCB1表达介导曲妥珠单抗耐药胃癌细胞对紫杉类药物敏感性下降我们首先对曲妥珠单抗耐药及野生型胃癌细胞进行荧光紫杉醇Flutax-2摄取及外排检测,确定耐药细胞的Flutax-2外排更多,于是我们进一步筛选曲妥珠单抗耐药胃癌细胞中表达上调的ABC家族,发现ABCB1的信使RNA(Messenger ribonucleicacid,mRNA)和蛋白表达水平明显增加,耐药细胞予沉默ABCB1处理后Flutax-2泵除减少,对紫杉类药物敏感性增加。另一方面,生物信息学分析可见,NCI-N87细胞的曲妥珠单抗耐药型对比野生型差异基因可富集于胆固醇稳态相关通路。于是我们对两个细胞株的野生型及耐药型进行Filipin染色显示细胞内胆固醇分布,可见在耐药细胞中,胆固醇明显富集于细胞膜。在细胞活性检测及平板克隆形成实验中,予甲基-β-环糊精(Methyl-β-Cyclodextrins,MβCD)耗竭耐药细胞的膜胆固醇后,耐药细胞对PTX及DTX敏感性明显增加,且Mβ CD处理后耐药细胞ABCB1表达下降,Flutax-2泵除明显减少,从而验证曲妥珠单抗耐药胃癌细胞中的质膜胆固醇富集上调ABCB1导致其紫杉类药物敏感性下降。3.富集的膜胆固醇通过促进转录及抑制蛋白降解上调ABCB1表达通过阅读文献,我们从Hh通路激活及CAV1调控两条途径探讨膜胆固醇调控ABCB1表达的机制。我们首先通过荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及蛋白凝胶电泳(Western blot,WB)验证野生型细胞与耐药型细胞中Hh通路激活情况,可见耐药细胞中转录因子GLI1靶基因转录表达上调,予Hh通路抑制剂Vismodegib处理则GLI1靶基因表达明显下降,且ABCB1转录表达也明显减少。予M β CD耗竭膜胆固醇后可见GLI1靶基因表达明显下降,同样ABCB1转录表达也减少。Hh抑制剂可明显增加曲妥珠单抗耐药胃癌细胞对紫杉类药物的敏感性。另一方面,为了对比耐药细胞及野生细胞中HER2及ABCB1的蛋白稳定性,我们对细胞予以环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX)时间梯度处理抑制蛋白质合成,行WB检测可见耐药株中ABCB1降解速度较慢,蛋白稳定性较高,而HER2降解较快。IP实验提示耐药株中Cav1与ABCB1结合减少,与HER2结合增加。予MβCD处理耐药株抑制CAV1可见ABCB1降解增加,HER2降解略减少,曲妥珠单抗敏感性增加。耐药株中HER2的溶酶体定位增加。上述实验基本证明,曲妥珠单抗耐药株中膜胆固醇通过激活Hh通路促进ABCB1转录,Cav-与ABCB1解离增加与HER2结合,减少ABCB1蛋白降解,增加ABCB1蛋白稳定性,促进了 HER2溶酶体途径降解,将曲妥珠单抗耐药与紫杉类药物敏感性下降相联系。结论本研究首次探讨了 HER2阳性曲妥珠单抗耐药胃癌对化疗药物敏感性的改变,发现其对多种药物敏感性下降。其机制主要是耐药细胞中膜胆固醇富集,一方面通过Hh通路促进ABCB1转录,另一方面通过CAV1增加ABCB1蛋白稳定性,最终导致耐药株中ABCB1表达上调,紫杉类药物泵除增加,从而介导紫杉类药物敏感性下降。本研究为HER2阳性胃癌一线经曲妥珠单抗联合化疗治疗进展后二线治疗方案的选择和改进,提供了思路和理论支持。