新城疫病毒CH2000株全基因组的序列测定及其对鹅的致病力试验

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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性、致死性传染病。该病发病急、致死率高,对养禽业的发展构成严重威胁,因此被世界动物卫生组织定为须通报的疫病(2005年之前为A类疫病),我国农业部将其列为一类疫病。新城疫病毒在分类地位上属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属(Avbulavirus)的成员之一,为单股不分节段的负链RNA病毒。整个基因组长度约为15kb,包含6个功能基因:3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,分别编码6个主要蛋白质(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白)。本研究选取4株本实验室分离保存的新城疫病毒,编号分别为CH2000、06-74、06-87和07-12,对其生物学特性和遗传特性进行了初步研究。采用OIE推荐的办法对其鸡胚平均致死时间测定(MDT)和一日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)进行了测定,结果四株分离株的ICPI分别为1.83、1.92、1.86、1.86,MDT为60h、67.2h、62.4h、52.8h,表明四株分离株均属于强毒株。采用RT-PCR对4株分离株F基因的主要功能区片段进行了扩增、克隆和序列分析。结果表明4株分离株F蛋白裂解位点的组成为112R-R-Q-K-R-F117,具有新城疫典型强毒株的分子特征,与其致病指数测定结果一致。遗传进化分析表明4株分离株在分类地位上均属于基因Ⅶ亚型,与近年来我国主要流行的基因型一致。参考GenBank中发表的相关全基因组参考序列,设计了9对特异性引物,采用RT-PCR方法对分离株CH2000全基因组进行扩增、克隆和序列测定,使用DNASTAR SeqMan进行全基因组序列拼接,通过绘制各基因的系统发育进化树来分析该毒株遗传变异情况,结果表明该分离株全基因组长度为15192nt,基因组长度符合“六碱基法则”。其全基因组核苷酸的同源性及分子进化关系与Goose paramyxovirus SF02、ZJ1两株毒株亲缘关系相对更近,由此推测此分离株可能与Goose paramyxovirus SF02、ZJ1两株病毒有着共同的祖先。选取CH2000和经典参考株F48E8,对15日龄的非免疫五龙鹅进行了人工感染试验。结果表明在攻毒剂量为105ELD50/1ml条件下,CH2000肌注组的发病率和死亡率均为100%,口服、滴鼻组的发病率和死亡率均为93%;参考株F48E8肌注组的发病率和死亡率均为100%、60%,口服、滴鼻组的发病率和死亡率分别为100%、53%。人工感染鹅的潜伏期为50-80小时,大部分在4-5天死亡。发病鹅表现明显的临床症状和病理变化。本研究通过对4株近年来新城疫病毒分离株进行系统的生物学特性研究,证实4株病毒均属于强毒株,在分类地位上属于基因Ⅶ型,与我国目前流行的主要基因型一致。通过对2000年分离到的CH2000进行全基因组序列测定,为进行新城疫病毒的遗传与衍化的研究提供了实验数据并进一步为NDV的反向遗传学技术奠定基础。通过模拟在自然状态下新城疫病毒对水禽的感染和致病性,为证明新城疫病毒在自然情况下的可感染水禽对其致病提供实验依据。
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