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目的：研究用小分子化合物三步法在体外诱导大鼠肝上皮样干细胞WB-F344细胞(WB细胞)为胰岛素分泌细胞(IPCs),并观察诱导的胰腺前体细胞移植到糖尿病大鼠体内能否进一步诱导分化为IPCs,并对体内外诱导的IPCs进行鉴定和功能评价。方法：1.体外诱导1.1诱导方案采用三步诱导法1)第一步WB细胞去分化为WB-1细胞(1)通过5-AZA5μM诱导培养2天(d)TSA100M诱导1d。(2)诱导培养基为：基础培养液包括knockout-DMEM的培养液和一些主要成分2%knockout-serum,1mM β-巯基乙醇,1%非必需氨基酸,1%B27,2mM L-谷氨酸,2%N-2,20ng/ml bFGF,20ng/ml EGF,100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。2)第二步诱导分化为胰腺前体细胞WB-A细胞(1)通过RA2μM,联合1乘ITS诱导分化7d。(2)诱导培养基为低糖DMEM培养液和上述一些主要成分。3)第三步在体外诱导分化为IPCs(1)尼克酰胺10mM培养7d。(2)基础培养液去除bFGF和EGF因子。1.2观察指标1)在体外用倒置相差显微镜下动态观察诱导细胞形态变化。2)用RT-PCR、免疫荧光对WB-A细胞和IPCs进行基因鉴定。3)葡萄糖刺激试验对诱导的IPCs进行功能评价。4)透射电镜分析诱导的IPCs结构。2.体内诱导2.1诱导方案胰腺前体WB-A细胞移植到糖尿病大鼠体内诱导分化为IPCs1)将第二步诱导的胰腺前体WB-A细胞1×106/只移植入糖尿病模型裸大鼠左肾囊膜下,动态观察血糖、体重变化；2)36d后将移植WB-A细胞组分两亚组,将一亚组做肾切除,另一亚组保持观察；3)60d后对移植WB-A细胞和对照组分别做IPGTT和胰岛素释放实验；4)60d后观察移植组织的HE染色和免疫荧光分析移植细胞的形态和结构。2.2观察指标1)动态观察移植组的血糖变化。2)移植前后血清空腹胰岛素浓度。3) IPGTT、胰岛素释放试验评估移植细胞功能。4) RT-PCR检测各阶段胰腺相关基因的表达量情况。5)HE染色和免疫荧光分析移植组织的形态和结构。结果：1.体外诱导1.1细胞形态学变化1)WB细胞在第1阶段：WB细胞由椭圆形或多边形向梭状细胞改变,增殖减慢,为WB-1细胞。2)诱导的第2阶段：细胞体积缩小,核浆比例增大,呈梭状细胞改变,诱导分化为胰腺前体WB-A细胞。3)诱导的第3阶段：细胞核浆比例减少,胞浆增多,但无细胞聚集,在体外诱导分化为IPCs。1.2RT-PCR1)诱导的第1阶段：肝脏的AFP和ALB基因表达减少,肝脏的去分化基因C/EBPP表达急剧减少,提示肝干细胞发生了去分化。2)诱导的第2阶段：WB-A出现了Pdxl基因表达,同时表达早期发育基因Ngn3和NKX2.2。3)诱导的第3阶段：IPCs有Pdxl、NeuroD和insulinI有表达,晚期发育的基因Pax4、Pax6和MafA,细胞功能基因GK、Kir6.2和内分泌基因insulinⅡ表达较WB-A上调。1.3免疫荧光5%WB细胞诱导为Pdx1表达细胞,IPCs细胞表达insulin.10%Pdx1表达细胞诱导为IPCs (0.5%WB细胞)。1.4葡萄糖刺激试验诱导的WB-A细胞对葡萄糖浓度变化无反应。诱导的IPCs对葡萄糖浓度变化有反应。1.5透射电镜诱导的IPCs有胰岛素分泌颗粒。2.体内诱导：2.1WB-A细胞诱导组血糖变化1)移植WB-A细胞15天后,糖尿病大鼠血糖逐渐下降或降至正常。2)移植的36天后,肾切除组血糖又逐渐升高,肾未切除组血糖仍正常。2.2WB-A细胞诱导组空腹血清insulin变化移植后30天较移植前1天增加2倍。2.3WB-A细胞诱导组功能评价IPGTT和胰岛素释放实验：与正常大鼠组分泌曲线相似。2.4体内诱导与体外诱导的IPCs的RT-PCR比较PC1、PC2、Pax4、Pax6、MafA、insulin Ⅱ、GK和Kir6.2较体内IPCs上调,Ngn3较体内IPCs和WB-A细胞表达下调,amylase、PP、somatostatin和glucagon仍无表达。2.5WB-A细胞移植组织HE和免疫荧光移植60d DM鼠的移植组织HE和免疫荧光均有insulin表达。结论：小分子化合物能够直接诱导肝干细胞为IPCs。诱导的胰腺前体细胞在高糖微环境下能进一步诱导为IPCs并改善糖尿病大鼠血糖,体内外诱导的IPCs为有功能的,高选择性β样细胞。为进一步建立肝干细胞高效、特异的向胰腺β细胞转分化的技术体系的研究奠定了基础,为DM细胞替代治疗提供了有潜力细胞来源和DM临床治疗提供了新途径。