研究目的:肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是我国常见的泌尿系肿瘤,发病率高,早期发现不易。肾透明细胞癌在其发生、发展的过程中容易受到肿瘤微环境中的各种细胞的调控影响。并且当其抗肿瘤免疫反应发生缺陷的时候,肾透明细胞癌患者往往临床预后不良。自然杀伤(Natural killer cells,NK)细胞是固有免疫系统的重要组成部分,在抗肿瘤效应中发挥了关键性的作用。本研究目的旨在探索NK细胞在肾细胞癌中免疫应答发生缺陷的机制。研究方法:(1)从肾透明细胞癌患者和对照者中,搜集手术切除组织和外周血标本,采用流式细胞术检测NK细胞的频数和表型。(2)检测NK细胞杀伤和分泌细胞因子的功能,分析其与肾透明细胞癌进展的关系。(3)培养肿瘤组织、癌旁组织及良性肿瘤旁组织原代细胞,将各组原代细胞与正常NK细胞在transwell小室上进行共孵育,判断肿瘤细胞与NK细胞细胞间通讯方式。提取细胞外泌体,进行电镜、WB、外泌体粒径分布检测,同时分析其与肾透明细胞癌进展的关系。将提取的外泌体与NK共孵育测NK细胞的功能。(4)分别提取肾癌肿瘤细胞系786-O、正常肾脏上皮细胞HK-2系培养上清中外泌体(exosome),并将提取的exosome与NK细胞进行共培养。使用ELISA检测细胞上清外环境细胞因子分泌情况,同时将786-O敲减TGF-β1后提取的exosome与NK细胞共孵育,检测NK细胞的杀伤功能,并使用WB检测TGF-β下游信号通路,分析肾透明细胞癌来源的外泌体诱导NK细胞功能失调的机制。研究结果:(1)我们发现肾透明细胞癌组织中浸润的NK细胞频数较癌旁组织明显较少,较非癌组织较多。而外周血中NK细胞比例并无明显差异。表型检测发现,肿瘤浸润的NK细胞活化性受体表达减少,抑制性受体表达增多,呈抑制性表型。(2)进一步检测NK细胞的功能,我们发现肿瘤浸润的NK细胞杀伤和分泌细胞因子的功能发生缺陷。比较不同肿瘤分期NK分泌及杀伤功能,随着患者肿瘤恶性程度增加,NK细胞的分泌及杀伤功能下降程度增加。(3)我们培养原代肿瘤细胞,通过transwell共培养体系我们发现,肿瘤细胞主要通过外泌体作用的方式抑制NK细胞功能。提取鉴定原代细胞的外泌体与NK细胞共孵育,发现外泌体可以抑制NK细胞的功能。比较不同肿瘤分期肿瘤组织分泌外泌体的情况,我们发现随着患者肿瘤恶性程度增加,外泌体的分泌浓度增多。(4)ELISA显示肿瘤细胞微环境大量分布TGF-β1,并且我们在外泌体上检测到TGF-β1表达。通过敲减TGF-β1,我们发现肾透明细胞癌来源的外泌体通过TGF-β1/SMAD信号途径作用于NK细胞,诱导其功能发生缺陷。结论:1.肾透明细胞癌中,肾透明细胞癌组织中浸润的NK细胞频数较癌旁组织明显较少,较非癌组织较多。NK细胞呈现抑制性的表型。2.肿瘤侵润的NK细胞分泌细胞因子及杀伤功能发生明显缺陷,并且随着患者肿瘤恶性程度增加,NK细胞的分泌及杀伤功能下降程度增加。3.成功培养了原代ccRCC细胞,ccRCC主要通过外泌体作用的方式抑制NK细胞功能。外泌体可以抑制NK细胞的功能,并且随着患者肿瘤恶性程度增加,外泌体的分泌浓度增多,抑制效果越强。4.肾透明细胞癌来源的外泌体通过TGF-β1/SMAD信号通路诱导NK细胞功能发生缺陷。