论文部分内容阅读
MHC不相合骨髓移植移植失败和相关并发症明显加重。其中，移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）是主要并发症和致死原因。应用非特异性免疫抑制剂或者剔除移植物中T细胞均能明显降低GVHD的发生，但是出现移植失败率、原发病复发率和感染率增高。因此，有必要保留移植物中的T细胞，对其进行调节，使其对受者产生特异性免疫耐受。通过阻断共刺激信号的传导，诱导T细胞无能是肯定、有效的诱导特异性耐受方法。但因为共刺激信途径众多，难以完全阻断，效果有限，因此需要进行多途径的调节。最近合成的Tju103是特异结合CD4分子上与MHC-Ⅱ结合的位点的小分子有机化合物，调节抗原信号，能有效降低同种异基因皮肤移植排斥和同种异基因骨髓移植GVHD发生。CTLA4-Ig是最有效的共刺激信号阻断剂之一。联用Tju103和CTLA4-Ig，同时调节抗原和共刺激双信号传导，可能对T淋巴细胞免疫抑制更深入，但能否保持CTLA4-Ig的特异性免疫耐受的诱导作用，不清楚。本实验联合应用Tju103和CTLA4-Ig进行T细胞活化的双信号调节，观察调节对供者T细胞的表型、功能以及异基因小鼠骨髓移植后GVHD、GVL（graft versus leukemia）效应和抗感染的影响，旨在探索一条能降低GVHD而保留GVL效应和抗感染能力的异基因骨髓移植特异性免疫耐受途径。 实验方法 （1）供鼠T淋巴细胞无能的诱导及表型和功能鉴定：分离供者(C57BL／6H-2b鼠)T淋巴细胞，在受者抗原(经MitC处理的BALB／cH-2d或CB6F1H-2bd鼠巨噬细胞)存在下和CTLA4-Ig及Tju103一起孵育，进行T细胞活化双信号调节。FCM检测经调节的供者T细胞的表型的改变，甲基琼脂造血祖细胞集落培养观察对造血的作用，MLR和MTT法鉴定对增殖反应性和细胞毒效应的影响。 （2）EL%11红白血病小鼠模型建立:从尾静脉给受鼠（BALB/c鼠和CB6FI鼠）接种可移植EL%H红白血病细胞，建立小鼠红白血病模型并进行鉴定。 （3）异基因小鼠骨髓移植GVHD模型建立:以C57BL/6鼠为供者，BALB/。和cB6FI鼠经“0C0全身照射后作为受者，进行C57BLz6H一ZbBALBzeH一Zd和C57BL/6H一ZbCB6FIH一Zbd小鼠骨·髓移植，建立完全异基因和半相合小鼠骨髓移植GVHD模型并进行鉴定。 （4）异基因小鼠骨髓移植实验:以C57BU6鼠为供者，以BALB/c或CB6FI鼠为受者，在上述模型基础上进行小鼠完全异基因和半相合骨髓移植实验，观察经cTLA4一Ig和Tju103联合调节的供鼠T细胞对移植后骨髓植入、GVHD、GVL效应、抗感染和皮肤移植耐受的影响 实验结果（1）T细胞增殖反应和杀伤效应:在耐受诱导源存在下，CTLA4一19和cTLA4一I留Tju103显著抑制C57BL/6鼠T细胞对己接触抗原 （BALB/c或CB6FI鼠）的增殖反应（抑制率:完全异基因移植为77.67士0.58%、87.67士1.16%;半相合移植为80.76士2.68%、89.54士3.15%），但保持对未接触抗原和白血病的反应性（抑制率:完全异基因移植分别为4.33士0.58%、4.67士1.16%，4.27士0.巧%、4.67士0.58%;半相合移植为4.41士0.95%、5.42士0.94%，6.10士0.88%、6.73士0.91%），显著抑制对己接触抗原的杀伤活性（抑制率:完全异基因移植分别为71.n士1.07%、76.85士2.69%;半相合移植为87.80士1.14%、95.12士2.56%），而保留对未接触抗原和白血病细胞的杀伤活性（抑制率:完全异基因移植分别为0.69士0.69%、1.27士0.27%，1.24士1.38%、2.07士1.32%;半相合移植为3 .31士0.49%、3.04士0.52%，2.20士0.96%、3.35士1.04%）;Tjul03则表现为非特异性的抑制（对接触抗原、未接触抗原和白血病的增殖反应和杀伤抑制:完全异基因移植分别为80.33士1.16%、80.33士0 .58%、80.67士0.58%，72.61士0.63%、74.25士0.74%、71.09土1.66%:半相合移植为81.36士2.84%、79.52士1.67%、79.59士1.75%，87.68士0.92%、83.58士1.57%、88.72士1.84%）。提示有耐受诱导源时CTLA4Ig和CTLAI岁Tjul03诱导特异性免疫耐受（p<0.05），两者组合效果最好（p<0.05）;而Tjul03则诱导非特异性免疫耐受 （P<0.05）。没有耐受诱导源，CTLA4一Ig、两者联合和Tju103一样诱导非特异性免疫抑制（P>0.05）。（2）细胞集落培养:无处理、CTLA4一lg、芍ul03和两者联合处理的供者T细胞，对CFU一GM形成的影响没有明显差别（p>0.05），CTLA4一Ig、Tjul03和两者联合明显提高BFu一E形成（完全异基因移植分别提高51.12士8.45%、35‘71士11，3%和59.18士14.57%，半相合移植分别提高79.27士10.%%、74.39士13.15%和93.90士18.320/0）印<0 .05)，但两两间无显著差别印>0.05)。（3）供鼠T细胞表面标志:CTLA4一Ig、Tjul02及两者联合均明显抑制供者T细胞CD69表达（抑制率:完全异基因移植分别为78.06士5.37%、79.58士16.62%和89.39士21.18%，半相合移植分别为78.17士9.55%、77.82士14.40%和89.26士13.07%）（P<0.05），以两者组合最显著（P<0.05）。CTLA4一Ig和两者联合提高供鼠T细胞高表达儿唯y49C)（完全异基因移植分别增加表达4.07士0.57倍和5.35士0.68倍，半相合分别增加5.37士0.87倍和6.04士1 .03倍） （P<0.05）?