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胰腺癌的恶性度程高，预后差，症状隐匿，近些年来全球范围胰腺癌发病率、死亡率均在上升，胰腺癌发病机制仍然不明确，这给早期诊断以及进一步治疗带来很大困难，只有真正揭示胰腺癌发病内在机制，才能寻找到有效的诊断及治疗方法。ARHI基因是1999年发现的一个母源印记抑癌基因，本实验室前期工作显示，ARHI蛋白在胰腺癌组织中的表达缺失占48.9％，其基因启动子呈现高甲基化(CpGⅠ45.5％；CpGⅡ27.3％％)改变。本研究构建了野生型ARHI基因真核表达载体，并将其导入到ARHI基因表达缺失的胰腺肿瘤细胞(Panc-1)中，深入探讨ARHI基因及甲基化在胰腺肿瘤演化中的作用和相关机制。肿瘤的发生、发展是多种基因参与、多阶段的过程，其中细胞信号传导通路与肿瘤的演化密不可分。胰腺癌中ARHI基因、甲基化、细胞信号传导通路的调节三者究竟处于什麽关系呢?本研究着重探讨了ARHI基因与细胞信号传导通路、去甲基化与细胞信号传导通路之间的内在联系，试图揭示抑癌基因及内在调控在肿瘤演化中的作用机制。本研究将分为以下三部分介绍。第一部分.ARHI在胰腺癌中的抑癌作用以及其机制研究采用质粒重组的方法构建了载有野生型ARHI基因的质粒pIRES2-EGFP-ARHI；选取ARHI基因缺失细胞系Panc-1为研究对象，分别将重组质粒pIRES2-EGFP-ARHI或空质粒(阴性对照)转染后进行了以下研究：1.Westemblot方法检测Panc-1细胞ARHI蛋白的重新表达以及ARHI蛋白对Panc-1细胞MAPK/ERK1/2、JAK-STAT3信号转导通路的影响，其中蛋白变化以与其参照蛋白灰度比值为单位；2.PI染色经流式细胞仪检测ARHI基因对胰腺癌细胞株Panc-1细胞凋亡、细胞周期的影响；3.通过生长曲线分析ARHI基因对Panc-1细胞增殖的影响；4.以亚甲基兰染色、Hoechst 33258染色分别观察了ARHI基因对增殖细胞、凋亡细胞形态学的变化。结果：1.在成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-ARHI后，转染入Panc-1细胞系，转染后的Panc-1细胞可表达ARHI蛋白；2.ARHI蛋白表达可显著减缓胰腺癌细胞Panc-1的生长，但对细胞形态学无明显影响；3.ARHI蛋白明显增加细胞凋亡百分率(P＜0.05)，但对细胞周期虽有影响但无统计学意义，Hoechst33258染色可见明显凋亡细胞形态；4.ARHI蛋白表达后显著减少MAPK/ERK1/2信号传导通路功能蛋白P-ERK表达，在120h其与T-ERK比值与对照组相比有明显差异(P＜0.05)；5.ARHI蛋白的表达对JAK-STAT3信号传导通路功能蛋白P-STAT3也具有明显的下调作用，其与T-STAT3蛋白比值分别在96h和120h时均与对照组有明显差异(P＜0.05)。小结：在成功构建ARHI基因真核表达载体pIRES2-EGFP-ARHI基础上对Panc-1细胞系的研究发现，ARHI基因抑制胰腺癌的可能机制包括：1.抑制胰腺肿瘤细胞的增殖，但不改变肿瘤细胞形态；2.导致胰腺肿瘤细胞的凋亡，但对肿瘤细胞周期影响不明显；3.通过降低细胞内信号传导通路功能蛋白P-ERK和P-STAT3的表达，下调与肿瘤发生相关的重要信号传导通路。第二部分.裸鼠胰腺癌荷瘤验证ARHI基因的抑癌作用机制为进一步验证ARHI基因对胰腺癌的抑制作用，本实验通过G418筛选的方法建立ARHI基因稳定转染的Panc-1细胞系，同时以空白质粒转染作为对照组，并通过RT-PCR和Western blot方法验证ARHI基因稳定转染的Panc-1细胞系有ARHI mRNA和蛋白的表达。将稳定转染细胞系和对照组细胞注射至裸鼠背部皮下建立胰腺癌裸鼠荷瘤模型，通过免疫组化方法验证稳定转染胰腺癌荷瘤中ARHI蛋白的表达，并分析比较ARHI转染组和对照组荷瘤模型体重和荷瘤生长状态的差异。结果：1.ARHI稳定转染的Panc-1细胞系有ARHI蛋白和mRNA的表达，而空白质粒转染组无相应表达，从而证实稳定转染细胞系建立成功；2.ARHI稳定转染细胞系注射的胰腺癌裸鼠荷瘤ARHI蛋白表达强阳性，而对照组ARHI蛋白表达阴性，证明胰腺癌荷瘤成功建立；3.ARHI稳定转染组与对照组相比，肿瘤生长缓慢(p＜0.05)，体积明显缩小(P＜0.05)，但裸鼠体重无明显差别。小结：通过本部分实验，成功建立了ARHI基因稳定转染的胰腺癌Panc-1细胞系，同时通过胰腺癌裸鼠荷瘤模型的建立，在动物水平进一步验证了ARHI基因对胰腺癌的抑制作用，为进一步探讨胰腺癌与ARHI基因的关系建立了良好的基础，并提供了一定的依据。第三部分.胰腺癌中甲基化与肿瘤细胞信号传导通路的研究本实验以人胰腺癌标本、胰腺癌P3、Panc-1细胞及裸鼠胰腺癌荷瘤模型为研究对象，通过以下方法初步探讨胰腺癌癌变过程中甲基化和信号传导通路之间的关系：1.Westernblot分析人胰腺癌标本、正常胰腺组织中MAPK/ERK1/2、JAK-STAT3信号传导相关蛋白的表达，以及去甲基化处理后以上2种信号传导相关蛋白表达的变化情况。同时利用裸鼠胰腺癌荷瘤模型在动物水平进一步验证以上结果；2.MTT法检测MAPK/ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059、去甲基化药物5Aza-dC以及二者联合对P3、Panc-1细胞增殖的影响；3.流氏细胞术检测不同浓度PD98059对P3、Panc-1细胞凋亡百分率及细胞周期的影响，用Hoechst33258染色观察PD98059对Panc-1、P3细胞凋亡形态学变化的影响；4.通过观察肿瘤的体积和裸鼠的体重变化，分析PD98059对裸鼠胰腺癌荷瘤生长的影响。结果：1.6份人胰腺癌患者组织标本中分别有3例和4例标本MAPK/ERK1/2、JAK-STAT3信号传导通路功能蛋白出现上调(P＜0.05)；2.与对照组相比，经去甲基化药物处理后，Panc-1细胞在96和120小时，P3细胞在120小时P-STAT3/T-STAT3蛋白比值下调明显(P＜0.05)，Panc-1、P3细胞在120小时P-ERK/T-ERK比值下调显著(P＜0.05)；3.与对照组相比，PD98059、5Aza-dC处理后，P3和Panc-1细胞的增殖均明显降低(P＜0.05)；其中在Panc-1细胞中，经PD98059 50umol/L和5Aza-dC 1umol/L联合作用后，对其增殖的抑制作用最明显(P＜0.05)，而在P3细胞抑制最明显的是PD98059 50umol/L组，说明PD98059 50umol/L与5Aza-dC 1umol/L对Panc-1细胞增殖的抑制有叠加作用，而在P3细胞这种叠加作用则不明显；4.PD98059 50umol/L可引起P3、Panc-1细胞凋亡百分率显著增加(P＜0.05)，并可使静止期(G1期)的P3细胞百分率增加(P＜0.05)，DNA合成期(S期)的细胞百分率降低，Panc-1细胞虽然有上述趋势，但统计学上无显著性差异；5.PD98059抑制胰腺癌荷瘤的生长是通过MAPK/ERK1/2介导。小结：1.人胰腺癌组织标本的MAPK/ERK1/2和JAK/STAT3信号传导相关蛋白表达异常；2.P-ERK/1/2蛋白具有促进胰腺癌细胞P3、Pnac-1增殖的作用；PD98059可阻断其增殖作用，且具有时间—浓度依赖性；3.P-ERK蛋白有抑制胰腺癌细胞凋亡的作用，抑制P-ERK蛋白后可引起胰腺癌细胞凋亡；4.去甲基化药物对肿瘤细胞具有抑制增殖、促进凋亡的作用，并可通过MAPK/ERK1/2细胞信号传导通路介导；5.P-Stat3蛋白在胰腺癌中表达增加，对于增值、凋亡的作用与P-ERK相似。无论PD98059还是去甲基药物均能改变MAPK/ERK1/2和JAK-STAT3蛋白的表达，说明在胰腺癌发生过程中，这两种信号传导蛋白之间可能存在一定的联系。总之，本实验从以上三个方面，对ARHI基因抑制胰腺肿瘤的相关机制进行了初步探讨，明确了ARHI基因与细胞信号传导通路、去甲基化与细胞信号传导通路之间的某些内在联系，进一步证实了肿瘤发生过程中多因素、多环节共同作用的机制，并为后续的工作奠定了重要的理论和实践基础。