中华鳖肉抗氧化肽的制备及其抗衰老功能研究

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中华鳖(Chinese soft-shelled turtle)是我国传统的滋补保健佳品。我国传统医学认为中华鳖具有延年益寿的功效,现代研究也表明中华鳖具有较高的营养价值,但是对于中华鳖抗衰老功效等方面的研究却鲜有报道。本研究以中华鳖肉蛋白为原料,利用酶法制备抗氧化活性肽,并以酿酒酵母为模式菌对其抗衰老活性进行评价,通过RP-HPLC分离纯化得到抗衰老活性最强的组分,对其氨基酸序列进行鉴定,并利用分子对接初步探索其抗衰老机制。主要研究内容与结果如下:中华鳖肉蛋白的营养价值和提取工艺研究。中华鳖肉中蛋白质的含量(湿重)为18.61%,其必需氨基酸构成比例符合FAO/WHO的模式。根据蛋白质不同pH值的溶解度差异,利用碱溶酸沉法分别在pH 11.0和pH 5.0时提取中华鳖肉蛋白,SDS-PAGE电泳显示其相对分子质量主要集中在29~200 ku,肌原纤维蛋白为构成鳖肉蛋白的主要蛋白质。中华鳖肉蛋白酶解产物的制备与理化性质研究。以抗氧化能力(DPPH·清除率、·OH清除率、Fe2+螯合率和抑制亚油酸自氧化能力)为主要指标,水解度为辅助指标,筛选得到中华鳖肉蛋白的最佳水解酶为碱性蛋白酶,通过单因素实验和正交优化实验确定最佳酶解参数为:料液比1:20(w/v)、酶添加量8000 U/g和酶解时间3.5 h。该条件下得到的酶解产物(Chinese shelled-turtle protein hydrolysate,STPH),水解度为19.90%,当STPH的浓度为5 mg/mL时,其DPPH·清除率、·OH清除率、Fe2+螯合率和抑制亚油酸自氧化能力分别为87.89%、10.83%、65.56%和63.24%。STPH中相对分子质量<1000 u的肽含量高达87.69%,其中与抗氧化能力相关的疏水性氨基酸、酸性氨基酸与芳香族氨基酸分别占氨基酸总量的37.22%、28.20%和8.29%。中华鳖肉蛋白酶解产物STPH对酿酒酵母时序寿命(chronological lifespan,CLS)的影响。CLS 6时,低、中、高剂量(1、2、4 mg/m L)STPH处理的酿酒酵母存活率分别较空白组增加了1.85%、5.77%和10.99%,STPH高剂量组酵母细胞的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化酶的活性与空白组相比分别提高了47.4%、35.4%和27.2%,脂质过氧化水平降低了44.7%。STPH还具有抑制胞内活性氧生成以及改善衰老细胞形态的作用。STPH的Fe2+螯合率与酿酒酵母CLS 6的存活率之间的正相关性高达0.816。中华鳖肉蛋白酶解产物STPH的分离纯化、序列鉴定以及与雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,Tor)的分子对接作用。通过制备型反相高效液相色谱对STPH进行两步分离纯化,得到Fe2+螯合能力最强的组分F3-1,其Fe2+螯合率和CLS 6时酵母细胞的存活率分别较STPH提高了10.83%和7.77%。利用液相色谱串联二级质谱对F3-1的氨基酸序列进行鉴定,得到6个含量丰富的多肽:TEAPLNPK、LVRGPR、KLLDPDGK、SKHPNLSAS、APLNPK和KYPHQK。利用分子对接模拟多肽TEAPLNPK、LVRGPR、KLLDPDGK对于Tor的作用,三个多肽均能够与FK506结合蛋白12(FK506-binding protein 12,FKBP12)和Tor的FKBP12-雷帕霉素结合结构域(FKBP12-rapamycin binding domain,FRB)成功对接,并能够通过氢键等相互作用与FKBP12-FRB形成更稳定的复合物,还能够增强FKBP12和FRB间的相互作用与结构稳定性。
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