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琼胶是存在于红藻细胞壁多糖间的粘性多糖,是目前世界上应用最广泛的三大海藻胶之一。琼胶酶(Agarase)是可催化水解琼胶的一类多糖降解酶的总称,在海水养殖业、食品、医药、分子生物学研究等方面中具有非常重要的应用价值。本课题从不同环境中筛选得到40株产琼胶酶微生物,从中获得16条琼胶酶基因片段,且克隆得到一条全长基因并在大肠杆菌中实现异源表达,随后对其酶学性质进行研究。具体实验结果如下:(1)从南日岛鲍鱼养殖场、广西红树林及舟山群岛等地采集的样品中筛选得到40株产琼胶酶微生物;通过形态观察和分子生物学鉴定,这些产酶菌株主要分布在Pseudoalteromonas sp.,Vibiro sp.以及Streptomyces sp.等种属中。(2)设计6对简并引物从25株产琼胶酶菌株中扩增得到16条不同的琼胶酶基因片段。其中包括9条GH50的琼胶酶基因片段,7条GH16的琼胶酶基因片段;从中选取1条来源于Vibrio sp.ZC-1的GH50琼胶酶基因片段序列用于扩增全长基因。利用TAIL-PCR的方法扩增得到Vibrio sp.ZC-1来源的琼胶酶基因,该基因全长2853 bp,编码950个氨基酸,其中1-25位氨基酸为预测的信号肽。(3)成功构建了表达载体pET-agaZC-1,并在大肠杆菌BL21中实现了重组表达。利用亲和层析法纯化重组酶rAgaZC-1,并对其酶学性质进行研究,结果表明:其反应最适pH为7.0,在pH 6.0～8.0的范围内稳定;最适反应温度为40℃,45℃时该酶不稳定,处理10 min以上就完全失活,而低于35℃时则比较稳定;Ca2+、Mg2+、β-ME对该酶活力具有明显的促进作用。酶的动力学研究表明,rAgaZC-1对琼脂底物的Km、Vmax和kcat分别为2.428 mg/mL、36.90μmol/(mg.min)和62.847 s-1。底物特异性研究表明该酶对琼胶底物具有很强的专一性,其降解琼胶的主要产物是新琼二糖和新琼四糖。本课题通过从不同环境中筛选产琼胶酶微生物,并进行基因克隆表达以及酶学特性的研究,旨在寻找新的琼胶酶基因和为琼胶酶的开发应用奠定基础。