研究背景肾母细胞瘤（nephroblastoma）又名。肾胚胎瘤、wiims瘤（WT）,是儿童最常见的腹膜后实体肿瘤之一。自90年代以来,肿瘤手术切除率近于100.0%,5年生存率达到80.0%。由于肾母细胞瘤为先天性疾病,发病年龄较低,儿童又有其自身特点无法及时准确感知病情,目前尚无行之有效的早期检测手段。临床实践证明,如果能够及早发现,及时治疗,部分术后的肾母细胞瘤患儿可达到临床治愈、长期存活的疗效。目前肾母细胞瘤主要依靠临床症状和超声检查、CT、泌尿系平片、静脉肾盂造影等影像学手段,但这些检查手段只有当肿瘤长到一定大小时才能被发现,敏感性差。此外,当前尚未发现肾母细胞瘤诊断特异性强的生物学标记物。因此,探索一种简单、快速、敏感性高和特异性强的新方法具有重要的临床意义。肾母细胞瘤的发生是多基因多阶段多因素的动力学过程,是癌基因激活和抑癌基因失活的结果,涉及到多个基因,基因突变或调控异常时,细胞内的蛋白质在成份和数量上都会有相应的改变,通过对蛋白质的动态观察可以了解肿瘤是否复发或转移的动态变化。蛋白质组学的发展为肿瘤预后监测提供了新的方法和技术平台。体外培养的细胞株虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性,但它具有成分单一,均质性好,实验条件容易控制等优点。尤其在做对比性研究时可避免由组织细胞成分复杂,细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠。蛋白质组学的表面增强激光解吸电离—飞行时间质谱（Surface EnhancedLaser Desorption/Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS）技术是近年开发的新型蛋白质组学技术,它应用基因芯片的设计原理,把层析、质谱等技术合理地与蛋白质芯片结合,可检测出传统方法难以鉴定的蛋白质和多肽,是发现蛋白质标记物的理想方法,具有快速、灵敏、高通量等特点。目前已经运用SELDI-TOF-MS技术筛选出了肾母细胞瘤患儿的特异性血清蛋白标记物,并建立了早期诊断、肿瘤分期、术后及预后监测的诊断模型,本研究应用SELDI-TOF-MS技术分析肾母细胞瘤细胞株、正常胚肾细胞株和肾母细胞瘤患儿术前、术后血清中的差异蛋白,检测出差异的蛋白质表达,进一步探讨用于肾母细胞瘤早期诊断的特异性蛋白质标记物,以建立高特异性和敏感性的肾母细胞瘤诊断模型,同时评价该模型对肾母细胞瘤诊断的应用价值。研究目的检测肾母细胞瘤细胞特异的蛋白质标记物,构建用于肾母细胞瘤早期诊断及鉴别诊断的蛋白质图谱模型。材料与方法1.1材料肾母细胞瘤细胞株（G401）和正常胚肾细胞株（CCC-HEK-1）均购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心。肾母细胞瘤患者血清标本100例（术前30例、术后70例）,均来自郑州大学第一附属医院小儿外科,所有肾母细胞瘤均经免疫组化和2名以上病理学教授证实。1.2主要试剂和仪器胎牛血清购自杭州四季清生物有限公司。F12培养液购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心。胰蛋白酶购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。RPMI-1640培养基购自GIBCO公司。标准分子量蛋白marker购自MBI公司。考马斯亮兰G-250（Coomassie brilliant blueG-250）购自美国Ameresco公司。BP121S型分析天平购自德国Sartorious公司。Hera CO₂培养箱购自德国GMBH公司。倒置显微镜购自日本Nikon公司。超声细胞粉碎机购自宁波新芝生物股份有限公司。紫外分光光度计Thermo Helios购自美国热电公司。乙酸钠、尿素、NaAC、SPA（Sinapinic acid）、HPLC水、CHAPS均购自美国Promega公司。表面增强激光解析电离-飞行时间质谱（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS）PBSⅡ（主要参数:收集范围为1000 Da-50000 Da;优化范围为2000 Da-20000 Da。）和弱阳离子蛋白质交换芯片（WCX2）购自美国Ciphergen Biosystems公司。蛋白质芯片WCX2表面结合有弱型阴离子羧基,可以被分析物表面的正电荷基团相互作用（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸等）而捕获蛋白,可用于检测高等电点的蛋白质和生物标记分子。应用软件:Proteinchip Software 3.2.0和Biomarker Wizard软件。1.3方法1.3.1患者血清的收集所有肾母细胞瘤患儿术前、术后外周静脉全血标本均于清晨空腹抽取,4℃静置1 h后以3000 rpm离心10 min,分离出的血清储存于-86℃低温冰箱中,术前编号为xq1-xq30,术后编号为xh1-xh70。1.3.2细胞总蛋白质的提取G401细胞采用含20%胎牛血清的F12培养液培养,CCC-HEK-1细胞采用含20%胎牛血清的DMEM培养液培养,细胞铺满瓶底后,用胰蛋白酶使细胞与培养瓶分离提取细胞悬液;置入4℃,低温离心机1000 rpm,5 min,弃去上清液,加入PBS液,吹打均匀,反复离心、清洗3次后,加入裂解液200μl,吹打混匀,上超声粉碎机充分裂解后,4℃,低温离心机12000 rpm,20 min,提取上清液,采用分光光度计测定上清的蛋白浓度,G401细胞裂解液用裂解液调至样品浓度为2g/L,CCC-HEK-1细胞裂解液用裂解液调至样品浓度为1g/L,分装-86℃储存。G401细胞收获3次,CCC-HEK-1细胞收获2次,以排除组间差别。1.3.3 WCX2蛋白质芯片操作步骤将标本置冰浴中解冻,100 mmol/L NaAC（PH=4）稀释后,和Bioprocessor预处理过的WCX2蛋白质芯片结合反应60 min,上述NaAC缓冲液清洗芯片,取出芯片风干后点50%饱和的SPA溶液,将芯片放入SELDI读谱仪中检测。1.3.4数据采集和结果分析蛋白质芯片采用PBSⅡ-C型读取数据,用已知分子量的蛋白质芯片将SELDI-TOF-MS系统校正到分子量误差小于0.1%。分析参数:激光强度为170,灵敏度为6,每个样本收集总点数140次。收集数据范围1000 Da-30000 Da,优化范围2000 Da-20000 Da。每份样品至少在芯片3个不同点进行检测,以排除不同芯片点之间的差异。1.3.5统计学处理采用Proteinchip Software3.2.0版本的分析软件自动采集数据,质谱原始数据经Biomarker Wizard过滤噪音,聚类分析处理后,对初步筛选出的质荷比峰数据做Wilconxon秩和检验,检验标准取α=0.01。每个m/z峰对样本区分的差异显著性不同。按照P值的大小可以比较每个质荷比峰在各样本中中表达差异的显著性程度。P值越小说明这个质荷比峰对区分两类样本越有意义。两个蛋白峰比较时,差异蛋白定义为蛋白峰强度相差一倍以上。相似蛋白为:如患者血清和体外培养蛋白质对比,质荷比相同即可;如体外培养蛋白质之间对比,不仅质荷比相同,且蛋白峰的强度相差一倍以下。采用SPSS13.0进行统计学分析,两样本均数比较采用独立样本t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析及q检验,取α=0.05为检验标准,即P＜0.05有统计学意义。以质量控制蛋白质芯片做重复性检测,其峰值的大小及其相对强度的变异系数（cv）均控制在0.05%和15%以下,具有良好的重复性。结果1.利用WCX2芯片分析肾母细胞瘤细胞裂解液与正常胚肾细胞裂解液之间存在的蛋白质表达差异采用PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读机自动收集数据,设有意义峰的信噪比（signal/noise）大于5,试验结果表明,WCX2芯片发现G401、CCC-HEK-1细胞差异峰共19个,其中4287 Da、4839 Da、4984 Da、5016 Da、5322 Da、5427 Da、5930 Da、8569 Da、10095 Da、10411 Da、10844 Da、12765Da蛋白质分子在肾母细胞瘤细胞G401中高表达,3020 Da、3150 Da、4083 Da、4435 Da、4705 Da、5491 Da、6881 Da蛋白质分子在正常胚肾细胞CCC-HEK-1中高表达。2.利用WCX2芯片分析肾母细胞瘤细胞（G401）裂解液与小儿肾母细胞瘤患儿术前血清之间存在的蛋白质表达差异采用PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读机自动收集数据,设有意义峰的信噪比（signal/noise）大于5,试验结果表明,WCX2芯片发现G401与小儿肾母细胞瘤术前血清中存在五处相似蛋白质,分别为4633Da、5051 Da、6143 Da、8569 Da、9295 Dao3.利用WCX2芯片分析肾母细胞瘤细胞（G401）裂解液与小儿肾母细胞瘤患儿术后血清之间存在的蛋白质表达差异采用PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读机自动收集数据,设有意义峰的信噪比（signal/noise）大于5,试验结果表明,WCX2芯片发现G401与小儿肾母细胞瘤术后血清中存在十三处相似蛋白质,分别为4100 Da、4290 Da、4298 Da、4394 Da、4504 Da、4548 Da、4634 Da、4800 Da、5267 Da、5495 Da、5763 Da、g570 Da、9296 Da。结论表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术结合细胞生物学检测肾母细胞瘤细胞株、肾母细胞瘤患儿血清的差异蛋白质表达,进一步探讨用于肾母细胞瘤早期诊断的特异性蛋白质标记物,以建立高特异性和敏感性的肾母细胞瘤诊断模型,同时评价该模型对肾母细胞瘤诊断的应用价值。