研究背景和目的衰老是任何生物生命过程的必然规律,随着世界范围内的人口老龄化问题日益突出,抗衰老领域已成为全球关注的焦点。皮肤是人体最大的器官,担负着保护、感觉、调节体温、分泌、排泄和免疫等诸多方面的作用。随着年龄增长,人体皮肤的组织、结构发生老化,出现皮肤松弛、萎缩,皮肤变薄、弹性减退,胶原蛋白减少、皮下脂肪损失,黑色素生成增加等。对于如何抗皮肤衰老这个关键问题,许多学者提出了不同的观点,目前研究主要集中在基因调控学说(基因组的突变积累),环境影响学说(有毒代谢产物的沉淀)、内分泌失调学说(激素不足)、皮肤衰老的自由基学说(过量自由基的形成)、及非酶糖基化衰老学说(交联的糖基化产物的生成异常增多)。糖基化,是胶原中游离氨基之间的一种非酶反应,氧活化基团诱导的氧化作用。而还原糖和蛋白反应所诱导的糖基化作用、还原糖和蛋白反应所诱导的糖基化作用是动物体衰老的两个重要原因。在某些异常物质的刺激下,胶原间的氨基易被暴露,引发与细胞外液的葡萄糖发生非酶糖基化反应,从而在皮肤中产生新的残余物即糖基化终末产物。糖基化终末产物增加,胶原蛋白形成分子间交联,结缔组织的通透性降低,组织延展性及硬度增加,胶原蛋白含量减少导致皮肤真皮层变薄,弹性下降,从而出现皮肤松垂、皱纹等,促进皮肤衰老。除了糖基化作用,皮肤胶原的改变和真皮血管化作用也在皮肤衰老中扮演重要角色。随着年龄增长,皮肤胶原含量减少,排列紊乱；真皮内血管网逐步减少,从而改变了血管壁的内部结构,直到血流停止。之前的研究表明,自体脂肪移植可以通过增加移植处体积改善皮肤的质量,这可能是由于间充质干细胞中含有脂肪干细胞或血管基质细胞所致。脂肪来源干细胞具有多向分化潜能,并具有类似于间充质干细胞的表面标记及基因表达。许多研究表明脂肪来源干细胞可以通过旁分泌或分化来达到创伤修复、免疫调节及抗凋亡的效果,脂肪来源干细胞生成细胞因子,这些细胞因子可以发挥不同的作用。最新的研究报道,脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)可以通过促进胶原合成,表皮增厚达到改善光老化引起皱纹。然而,ASCs的抗衰老作用的机制尚不明了,ASCs是通过何种机制促进胶原合成?为何脂肪移植后可以改善皮肤质量?因此,为了进一步探讨皮肤抗衰老机制,我们利用D-半乳糖诱导的皮肤衰老裸鼠实验动物模型,运用组织学及免疫组织化学分析来发现ASCs抗皮肤衰老的直接或间接机制。目的1、观察移植脂肪来源干细胞能否抑制D-半乳糖诱导的裸鼠糖基化作用,动态观察脂肪来源干细胞移植后的存活情况,为移植脂肪来源干细胞应用于临床提供试验依据。2、观察移植脂肪来源干细胞对D-半乳糖诱导的裸鼠皮肤中自由基、衰老相关分子标志,真皮结构及血管化方面的影响,阐述移植脂肪来源干细胞抗皮肤衰老的可能机制及意义,为脂肪来源干细胞抗皮肤衰老提供进一步实验基础。方法1、脂肪来源干细胞的分离与提取本实验中的20只C57BL/6-GFP小鼠均来自南京大学动物模式研究所。断颈处死后取其双侧腹股沟处脂肪组织,采用酶消化法分离并培养ASCs,通过形态学鉴定是否符合间充质干细胞特性。2、移植脂肪来源干细胞存活率的观察经传代培养后,将细胞数量达到1×106的ASCs配制成细胞悬液,行裸鼠背部真皮内注射,通过活体荧光成像仪对移植后脂肪来源干细胞的存活情况进行不同时间点观察。3、D半乳糖诱导的皮肤抗衰老模型的建立低剂量的D半乳糖诱导的裸鼠衰老模型被广泛用于抗衰老领域的研究。糖基化终末产物增加被认为皮肤衰老的一大重要原因。有研究证明,糖基化终末产物抑制剂氨基胍可以抑制皮肤衰老表型。本实验中的80只6周龄裸鼠均来自南方医科大学实验动物中心。动物随机分为4组,分别设计为：空白对照组、D-半乳糖诱导组+PBS组、D-半乳糖+ASCs治疗组、D-半乳糖+氨基胍组。其中后3组连续8周每日背部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg,注射均按无菌操作进行。2周后,三组分别接受1×106ASCs、AG(100mg/kg)、PBS液行小鼠背部真皮内注射。饲养4周后,处死,取皮肤组织置于-70°冰箱内备用。4、10%皮肤匀浆的制备及衰老相关标志物、糖基化终末产物的检测各组分别取裸鼠背部皮肤组织约0.5g,经预冷的生理盐水漂洗,除去皮下脂肪和其他结缔组织,滤纸拭干,称重,量筒量取该组织块9倍重量预冷生理盐水,用内切式组织匀浆机制成10%组织匀浆(在冰水中),反复冻融3次,使细胞完全破碎,内容物全部游离在液相中。取各组上清液进行衰老相关标志物及糖基化终末产物的测定。5、组织学检测取各组组织块切片行HE染色、CD31及VEGF免疫组织化学染色。观察并比较皮肤样本的真皮厚度和胶原含量的变化,以及CD31和VEGF表达量的变化。6、统计学分析所有数据均使用SPSS13.0进行统计学分析,结果均使用ONEWAY-ANNOVA进行统计学分析,P<0.05为有显著统计学差异。结果1、脂肪来源干细胞具有长梭形及成纤维细胞样形态学特征,可以形成细胞集落,符合间充质干细胞特性。将GFP小鼠的ASCs注射到裸鼠背部真皮内,通过活体荧光成像仪可见注射区组织中有大片散在的绿色荧光,证明细胞注射到真皮层中可以存活,ASCs注射入真皮后能存活28天。2、连续皮下注射D-半乳糖可成功诱导出裸鼠衰老模型。移植ASCs后,可以逆转衰老相关标志物MDA、SOD及糖基化终末产物AGEs的表达。HE染色显示移植ASCs细胞后真皮厚度及胶原含量较对照组明显增加。免疫组织化学检测显示移植ASCs细胞后皮肤中CD31及VEGF表达量较对照组明显增强。讨论干细胞具有自我更新与多向分化潜能,特别是ASCs具有来源广泛、易于获取,不存在伦理学及道德问题等特点。目前,ASCs已被广泛用于临床试验,包括治疗骨缺损,直肠阴道瘘,移植物抗宿主病、急性心梗、放疗后并发症等的治疗。尽管ASCs疗法被临床证实有很好的应用前景,但其潜在的机制目前尚未完全阐明,这必将成为未来研究的重点。在本研究中,我们试图证实ASCs在抗皮肤衰老方面的作用及其可能机制,尤其是ASCs拮抗D-半乳糖诱导的衰老裸鼠的糖基化反应及恢复皮肤功能方面的研究,为临床延缓皮肤衰老的治疗提供新的思路和方法。通过我们的实验,我们发现：1、ASCs注射入真皮后能存活28天。2、ASCs降低糖基化终末产物的水平及逆转衰老相关标志物如超氧岐化酶和丙二醛的水平,从而逆转衰老表型,其作用类似于糖基化终末产物抑制剂氨基胍。3、ASCs移植能增加真皮厚度及胶原含量。4、ASCs移植能增加皮肤内的血管密度及血管内皮生长因子的表达,证实了ASCs为皮肤组织提供营养这一科学假说。然而,因ASCs移植后存活率低等缺点,限制了其在临床上的广泛应用。本研究将C57BL/6-GFP小鼠的ASCs注射入裸鼠背部,能成功通过生物发光示踪。据我们所知,这是第一次通过生物发光发现ASCs注射入皮肤真皮层后细胞能够存活。有趣的是,我们意外的发现ASCs移植入真皮层后存活率非常低。ASCs注射入真皮后28天后,通过活体荧光成像仪只能见到非常少的散在绿色荧光,几乎所有的细胞濒临死亡。这个结果与其他实验如注射入神经及心脏实验研究的存活结论基本吻合。移植后的低存活率成为细胞疗法的一大“绊脚石”。低存活率可能是由于局部免疫细胞的吞噬作用造成,因为我们使用的不是自体细胞。但是部分研究者对骨髓间充质干细胞的同基因或同种异体细胞移植的研究也被证实移植后细胞的存活极其有限。尽管能检测到移植后ASCs的分布情况,但是不能完全解释其靠何种机制如何存活下来,我们猜想可能是源于ASCs的旁分泌作用。皮肤衰老包括内源性衰老和外源性衰老。内源性衰老,即随着衰老相关标志物的改变而出现的正常的皮肤老化。先前的实验证实D-半乳糖注射可以通过改变糖基化终末产物及衰老相关标志物如超氧岐化酶和丙二醛活性诱导出衰老表型。本研究通过注射D-半乳糖诱导皮肤衰老裸鼠模型证实了这一点。而糖基化终末产物抑制剂氨基胍也被证实可以抵抗D-半乳糖诱导的皮肤衰老,糖基化终末产物是D半乳糖诱导的衰老模型重要的中间媒介。而组织中过量的糖基化终末产物生成和糖基化蛋白的慢性聚集可促进衰老的进程,从而损伤线粒体功能,降低秀丽隐杆线虫及小鼠寿命。尽管ASCs不能像氨基胍一样有效的抑制AGEs的生成,但我们的实验证实ASCs移植仍然可以抑制糖基化终末产物的形成。细胞在体内具有广泛的抗氧化防御机制以保护其免受活性氧的损伤。而抗氧化酶包括超氧岐化酶在清除氧自由基方面发挥重要作用。超氧歧化酶是一类金属酶,催化超氧化物阴离子中分子氧和过氧化氢的歧化作用,从而形成一个细胞抗氧化防御机制的重要组成部分。SOD在细胞和组织的有三种存在形式：存在于细胞质中的铜／锌-SOD(SOD1),存在于线粒体中的锰-SOD(SOD2)和细胞外基质中的SOD (SOD3)。铜／锌-SOD及锰-SOD可能是抵抗氧自由基的重要防御元素。研究表明,通过蛋白质组学分析研究证实ASCs可以上调包括SOD在内的112个蛋白质,而某些蛋白质可以通过上皮细胞达到抗氧化效果。本研究中,我们发现ASCs可逆转由D-半乳糖诱导的衰老相关标志物SOD及MDA的氧化应激水平,可能是由于ASCs分泌蛋白如SOD和细胞因子在体内通过抗氧化发挥重要作用的结果,其作用类似于糖基化终末产物氨基胍,通过ASCs分泌因子修复创伤及抗皮肤衰老。皮肤衰老主要与真皮成纤维细胞减少及其生物学功能的下调有关。Kim等的研究发现ASCs上清液能够促进真皮内成纤维细胞增殖及一型胶原的分泌,减少成纤维细胞凋亡的能力。另一实验中还发现通过注射ASCs可以改善由UVB诱导裸鼠产生的皮肤皱纹,使真皮内胶原含量增加,真皮增厚。本研究证实ASCs可以逆转由D-半乳糖诱导裸鼠的真皮厚度及胶原分泌。虽然大量的研究表明ASCs可以分泌胶原,但是我们认为ASCs主要通过旁分泌机制促进皮肤内成纤维细胞增殖及胶原的分泌,使真皮内胶原含量增加,真皮增厚。促进血管新生被认为是ASCs治疗皮肤抗衰老另一种解释。大量证据表明,ASCs可以通过分泌血管内皮生长因子和肝细胞生长因子促进组织的血管生成,本研究的结果证实移植ASCs可通过分泌血管内皮生长因子诱导皮肤组织的血管新生,而CD31免疫组织化学染色实验更加证实ASCs为皮肤组织提供营养这一科学假说。尽管有研究证实ASCs可分化为血管内皮细胞,使血管新生,从而给皮肤带来更多营养,改善皮肤质地,但是考虑到ASCs移植后28天几乎很难被检测到,我们认为ASCs更多的是通过旁分泌机制参与组织损伤修复,促进血管生成。结论ASCs可以抑制D-半乳糖诱导的皮肤衰老裸鼠的糖基化水平,并逆转衰老相关标志物的表达及糖基化终末产物的形成,作用类似于糖基化终末产物抑制剂氨基胍。注射ASCs可用于预防糖基化作用引起的皮肤衰老。