脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)在平战时都较为常见，世界范围内近几年脊髓损伤的发生率在增加，由此带来的截瘫病人仅美国每年就约有10万人。脊髓作为中枢神经的一部分，具有上、下行传导束的解剖学特点，即使局部的损伤也会带来严重的后果，损伤平面以下的机体部分与大脑的联系中断，可导致永久性的偏瘫或四肢瘫以及瘫痪部位感觉功能丧失，或者伴有疼痛、运动和自主反射加强等症状。由于其组织结构的特殊性以及损伤导致的一系列病理变化，使得脊髓损伤的治疗进展缓慢。传统观点认为中枢神经系统(central nervous system，CNS)损伤后不可修复和再生，直至1981年Aguayo等通过大量实验提出了突破性的新观点，认为损伤后的中枢神经轴突在合适的环境中可以再生。近年来由于神经分子生物学等领域的迅速发展，人们对神经元轴突再生调控因素有了进一步的了解，在此基础上，研究者尝试了许多新的治疗策略，取得了令人鼓舞的成果，给临床治疗脊髓损伤带来了曙光。但是，如何使损伤轴突再生并最大限度地得到功能恢复，一直是脊柱外科学界关心的问题。 第四军医大学博士学位论文 脊髓损伤后影响神经轴突生长或再生的因素可分为两大类：一类 是能促进诱导神经生长的因素：如多种促进神经生长的神经营养因子 和为再生的轴突提供桥梁及管道。支持引导神经生长的雪旺氏细胞及 细胞外基质成分；另一类是抑制轴突生长的因素：如脊髓断端产生的 囊腔和瘫痕组织以及一些抑制性生长因子等。目前，治疗外伤性脊髓 完全横断性损伤的研究，主要是围绕这两方面进行。 0源性字经营养因子（bf。ifl－dCfiVCdnCUfotrOphiC fdCtof，BDNn是神 经生长因于…erve growth factors，NGFS）家族成员之一，它能支持若干种离 体培养神经元存活，其mRNA在脑内分布广泛，这提示BDNF对中枢 神经系统的各类神经元起着重要作用。BDNF在体处理能救活本来会 程序性死亡的运动神经元，阻止因轴突切断引起的运动神经元大量死 亡。BDNF对离体培养的脊髓运动神经元的存活有促进作用，在特定 发育时期的脊髓及肢芽中能检测到这些营养因子的mRNA，在运动神 经元中又发现它们受体的mRNA。因而BDNF生理上可能就是一种运 动神经元生长因于。上述活体研究中均需连续注射蛋白质因于，若应 用基因治疗的途径，可以通过导入的外源基因在体内的表达，在一段时 期内持续提供蛋白治疗，这对中枢神经系统具有更大的优越性。所以 采用转移外源基因方法提供蛋白因于已在神经损伤的研究中）’泛应 用。J 嗅粘膜神经元是体内唯一生后形成的神经元，它在成熟的个体内 可持续分裂。该神经元的轴突自嗅粘膜处长入嗅球有赖于特异的嗅鞘 细胞（olfactor ensheathing cells，OECs）的支持和引导。OECs兼具雪旺 细胞和星形胶质细胞的特点，但它与二种细胞又有不同。OECS可伴嗅 粘膜神经元的轴突进入CNS，并引导轴突终止于嗅球内正确的部位。因 ．3－ 第四军医大学博士学位论文 此，它是目前己知唯一能跨越PNS－CNS边界的细胞。在体外培养时，它 能形成髓鞘包裹神经元的轴突，促进横断后轴突的再生。用移植OECS 的方法治疗人类脊髓损伤的优点在于可直接获得患者的嗅粘膜进行细 胞培养，这样就不存在排斥反应或兔疫抑制的问题。但是，利用OECS 作为受体细胞转入并表达BDNF基因，将体外转染并表达BDNF的 OECS移植修复脊髓损伤，尚未见报道。 本实验首先将获赠的含有全长人BDNF基因的pCDNASDNF质 粒作为＊＊N下基因来源，构建了＊＊＊F重组腺病毒：利用B＊＊F重组 腺病毒体外感染OECs，实现了BDNF基因的转入和表达，并通过与 脊髓神经元共培养实验证实了BDNF的生物学活性；最后我们还将表 达和分泌BDNF的OECS移植到脊髓横断损伤模型，初步观察到中枢 神经轴突的再生和部分功能恢复。为临床应用基因修饰的OECS治疗 脊髓损伤打下基础。主要结果如下： 1．改进和完善了OECs的纯化方法。文献报道的成年大鼠嗅球来源 的OECS培养，单纯应用免疫纯化，可以达到95％以上。我们实践中 发现单纯免疫纯化很难去除成纤维细胞和上皮样细胞，利用OECS进 入有丝分裂的时间晚于上述细胞的特点，我们在接种后2物加入阿糖 胞昔，作用 48h后加入牛垂体提取物（bovine putultory extract，BPt）， 再进行兔疫