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前言 脂肪是人体重要的三大供能物质之一,是由甘油和脂肪酸组成的三酰甘油酯。其中脂肪酸按其结构分为饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸。在不饱和脂肪酸分子中,因双键位置的不同产生异构化分子,可分为顺式脂肪酸和反式脂肪酸(transfattyacids,TFA)。TFA的主要来源有两类,一类为天然来源,另外一类为工业来源。天然的TFA主要来自于反刍动物(如牛、羊)脂肪组织及其乳制品。工业来源的TFA主要产生于油脂的氢化、精炼、储存和食品加工过程中,其中油脂的部分氢化为食品中TFA的最主要来源之一,氢化油广泛用于一系列食品中,主要为涂抹酱、烘焙食品及快餐中。其中油酸(oleicacid,OA)的反式异构体,即反油酸(elaidicacid,EA;trans-9-18∶1)为工业来源TFA的最主要异构体,约占30%,是TFA的主要代表物之一。近几年随着生活节奏加快、东西方交流的增加,国民饮食习惯不断西化,氢化油脂的生产和应用不断扩大,工业来源的反式脂肪酸已深入国人的生活,在膳食中的比重逐渐升高。膳食中80%~90%的TFA来源于加工食品,有学者分析我国日常膳食原料,测定结果表明我国食物中普遍存在TFA。 工业来源的TFA很容易被人体吸收、代谢,沉积在脂肪、心、肾、肝、肌肉等多器官组织中。人日常摄入TFA所产生的有害作用,主要是由工业来源的TFA所引起。较高的TFA摄入可导致代谢紊乱:对脂质循环产生不利影响,引发系统性炎症,加重胰岛素抵抗,增加内脏脂肪和体重。另外两项长期的人群前瞻性观察研究中提示TFA的摄入促进体重增加,特别是腹部脂肪的积累。而腹型肥胖与胰岛素抵抗及脑血管疾病患病风险三者是紧密相联系的。TFA的摄入在肥胖的发生发展中具有无法估量的影响,但人们对TFA与肥胖发生发展之间的具体机制了解较少。 肥胖人群体内脂肪大量蓄积,脂肪组织分泌的脂联素(Adiponectin,APN)等各种脂肪细胞因子生成异常,被认为是慢性低炎性状态、胰岛素抵抗、糖尿病、心脑血管等疾病发生发展的重要原因。如脂联素在体内生理功能主要是增加胰岛素敏感性,促进糖脂代谢,改善胰岛素抵抗,脂联素还能通过抑制动脉粥样硬化因子的产生和抑制血管内皮细胞炎症及黏附等机制发挥抗动脉粥样硬化的作用。因此研究TFA对脂联素生成的影响有助于理解TFA与肥胖发生发展及其相关疾病之间的关系。 以往人们关于TFA对脂肪组织作用的研究,实验动物结果往往受种属差异的影响;而一些人群膳食调查及干预研究,大多集中在TFA对人血脂代谢和血糖代谢方面的影响,或是目前人们发现TFA摄入降低血浆中脂联素水平,而对人脂肪细胞脂联素生成的影响作用了解甚少。本研究采用人脂肪细胞作为研究对象,将其直接暴露于TFA的典型代表物EA及其同分异构体OA。观察OA和EA对人脂肪细胞脂联素生成的影响,可消除种属差异对结果的影响,同时也避免了人群调查及干预研究中的一些混杂因素的干扰作用。 本实验将来源于人腹部皮下脂肪组织的前脂肪细胞(humanadiposetissue-derivedstromalcells,hADSCs)诱导分化为成熟脂肪细胞后暴露于OA和EA中。同时并对其供体来源的均衡性做检验,观察其对脂联素的基因和蛋白表达水平的影响,并探讨油酸和反式脂肪酸对脂肪细胞产生以上影响的可能作用机制,为TFA对脂肪细胞内分泌功能影响的机制研究提供参考。 实验方法 采用体外细胞实验。取剖腹产手术产妇的腹部皮下脂肪组织,分离hATSCs并传代培养。并对细胞供体来源做均衡性检验。用MTT比色法检测细胞增殖活力确定合适的OA、EA暴露浓度。诱导hATSCs向成熟脂肪细胞分化,采用油红O染色和苏木精复染的方法从形态学上鉴定成熟脂肪细胞。Real-TimePCR方法检测孕产妇脂肪组织对脂肪细胞因子脂联素、瘦素、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)的表达水平,以及检测暴露于OA、EA后的成熟脂肪细胞的APN表达水平。采用酶联免疫吸附试验ELISA方法对其蛋白表达水平进行检测。采用游离脂肪酸(freefattyacids,FFA)检测试剂盒对细胞外FFA进行检测。 实验结果 1、供体组织来源均衡性检验——孕产妇妊娠期增重对孕妇自身脂肪细胞因子表达的影响 对照美国IOM制定的孕期增重推荐的标准,将供体妊娠期体重增长划分为三组,即孕期体重增加不足组(L)、正常组(N)、过度组(E)。孕妇妊娠期脂肪组织APN、Lep和TNF-α基因mRNA表达水平的差异,结果显示孕妇妊娠期体重增长程度不同,对孕妇自身脂肪细胞因子表达影响差异无统计学意义(P均>0.05)。 2、hATSCs的原代培养及诱导hATSCs向成熟脂肪细胞分化(油红O染色、苏木精染色) 初分离的细胞接种4h后开始贴壁,约24h后细胞开始伸展,呈成纤维细胞样梭形,生长有方向性。约5~9天后细胞可传代,传代后细胞仍呈成纤维细胞样生长。 将持续诱导分化9~12天左右的hATSCs油红O染色和苏木精染色。经油红O染色后可见,汇合的细胞因收缩而形成网状结构,胞质内有大量油红O染色颗粒存在。苏木精复染,细胞核呈深蓝色。 3、OA暴露对hATSCs增殖/毒性的影响 暴露于OA培养24h、48h、72h后,当OA浓度范围在0~25μmol/L时,对hATSCs增殖的影响差异无统计学意义(P均>0.05);当OA的浓度≥50μmol/L时,对hATSCs的增殖有抑制作用(P均<0.05)。 4、EA暴露对hATSCs增殖/毒性的影响 暴露于EA培养24h、48h、72h后,当EA浓度范围在0~25μmol/L时,对hATSCs增殖的影响差异无统计学意义(P均>0.05);当EA的浓度≥50μmol/L时,对hATSCs的增殖有抑制作用(P均<0.05)。 5、OA和EA对APNmRNA表达及蛋白生成水平的影响 与对照组(0μmol/L)比较,5、25μmol/LOA暴露组人成熟脂肪细胞APNmRNA的表达水平均较低,EA各剂量暴露组(1、5、25μmol/L)人成熟脂肪细胞APNmRNA的表达水平均较高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组(0μmol/L)比较,OA与EA各剂量暴露组(1、5、25μmol/L)人成熟脂肪细胞APN蛋白生成水平均较低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。 6、EA和OA暴露对人脂肪细胞脂肪生成的影响 EA和OA各剂量暴露组(1、5、25μmol/L)与对照组相比较,OA与EA暴露组相比较,培养液上清中游离脂肪酸含量差异均无统计学意义(P均>0.05)。 结论 1.将人成熟脂肪细胞暴露于油酸96小时,油酸抑制脂联素mRNA表达及脂联素蛋白生成的作用。 2.将人成熟脂肪细胞暴露于反油酸96小时,反油酸虽促进脂联素mRNA表达,但是抑制脂联素蛋白生成的作用。 3.反油酸和油酸对人脂肪细胞的脂肪生成无影响。