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研究背景:索拉菲尼作为中晚期肝癌患者的关键治疗用药,其疗效受限可能与药物诱导肝癌细胞自噬有关。研究发现内质网跨膜蛋白IRE1的活性调节可影响索拉菲尼的杀伤作用。本研究旨在探讨基于IRE1的细胞自噬调节对肝癌治疗的影响。方法:首先,采用慢病毒介导的RNA干扰技术构建靶向IRE1敲减稳转Hep3B细胞株,并通过qRT-PCR、免疫蛋白印迹等方法检测IRE1表达进行验证。然后采用台盼蓝染色在体外探究IRE1干扰稳转Hep3B细胞IRE1下调联合索拉菲尼对细胞杀伤作用的影响,同时通过免疫蛋白印迹检测相关信号分子水平从而揭露自噬与内质网应激交互在其中发挥的作用。最后,通过进一步药物干预研究该稳转细胞IRE1酶活性抑制联合自噬抑制剂羟氯喹对索拉菲尼治疗疗效的影响及作用机制。结果:本实验成功构建慢病毒介导的靶向IRE1敲减稳转Hep3B细胞及空载的阴性对照细胞,且敲减组IRE1抑制效率最高可达90%。台盼蓝结果显示抑制IRE1表达可增强索拉菲尼对肝癌细胞的杀伤作用,进一步研究发现IRE1下调联合自噬抑制剂羟氯喹可显著增加索拉菲尼对人肝癌细胞疗效。免疫蛋白印迹结果显示,索拉菲尼可诱导IRE1的表达,而抑制PERK活性,且可上调自噬活动水平。相比阴性对照组,在慢病毒介导的IRE1敲减稳转株中索拉菲尼的这种作用被减弱了。HCQ发挥着自噬抑制剂的作用。我们惊奇的发现,敲减IRE1后,索拉菲尼联合HCQ作用下自噬底物P62对比其他各组降解明显增多,即自噬水平被进一步促进而非抑制,同时放大了对caspase3的剪切作用,即促进细胞凋亡。结论:我们的研究结果表明,UPR信号通路中IRE1和PERK对细胞命运抉择发挥着不同的作用,IRE1是“保护信号”而PERK为“致死信号”,索拉菲尼耐药机制可能与调节二者水平及诱导“保护性”自噬有关。更重要的是,细胞内存在内质网应激与自噬的交互作用,其中IRE1可能担任着自噬模式切换“开关”的角色,靶向作用于IRE1使其表达下调后,联合HCQ可导致索拉菲尼诱导的自噬模式由“保护性模式”转向“致死性模式”而促进细胞凋亡,从而导致癌细胞死亡率显著增加。