背景和目的自发性脑出血(Spontaneous intracerebral hemorrhage, ICH),是临床最常见的脑血管危急重症之一,占全部脑卒中的20%-30%,主要为高血压小动脉硬化引起的血肿,致死、致残率极高。目前临床上除了运用传统脱水药物外,仍缺乏有效的治疗策略来减低死亡率和改善不良预后。因此,针对ICH后继发脑损伤的干预措施变得尤其重要,成为降低致死致残率和改善预后的关键和临床转化研究的热点5。大量的动物实验和临床研究证实,血脑屏障(Blood-brain-barrier,BBB)的破坏是脑出血发生后的一个普遍而重要的病理生理变化,且BBB结构和功能的损伤在ICH之后的早期脑损伤病理过程中发挥了重要的作用：ICH之后诱发血肿周围的BBB通透性发生病理性增强,致使BBB的控制物质传递的生理功能被破坏,继而导致了血肿周围的血管源性脑水肿。临床上,ICH血肿占位效应后继发的脑水肿,与血脑屏障损伤导致的血管源性水肿密切相关,是导致ICH患者早期脑损伤和不良预后的主要因素之一。因此,针对ICH早期血脑屏障损伤的修复,可能成为未来ICH等多种脑微血管损伤相关疾病的潜在治疗靶点。近年来,大量研究显示ICH导致的炎症损伤在ICH继发性损伤中发挥了重要的作用4。ICH后的早期,由血肿分解释放多种活性物质可以激活神经系统的固有免疫细胞(包括小胶质细胞的激活,中性粒细胞浸润)。脑出血后,各种刺激(如凝血酶和谷氨酸)可以激活小胶质细胞启动炎症反应,随后释放促炎细胞因子和趋化因子,从而募集外周中性粒细胞和淋巴细胞迁移到血肿周围,增强神经炎症11-13。因此,在早期,针对ICH后继发性神经损伤中的神经炎症反应为靶点的研究成为寻找ICH新的治疗策略的研究热点4。多巴胺是一种儿茶酚胺类神经递质,主要有两种受体亚型(多巴胺1类受体,多巴胺2类受体,DRD1和DRD2)。既往报道中发现,在缺血性卒中的梗死灶边缘和核心区DRD1和DRD2的表达均显著增加,结果提示D1和D2受体可能都参与了卒中后的神经保护作用。越来越多的报道显示：多巴胺D2受体及其激动剂在调节外周组织微血管屏障的完整性中发挥了十分重要的功能,这一发现在肿瘤的抗血管治疗的研究中开展了深入的研究。最近的研究表明,多巴胺主要通过D2受体的介导可以稳定血管的形态和抑制肿瘤的血管生成作用；在随后的研究中,myrthala等学者进一步证实了在肿瘤血管系统中DA的抗血管生成作用是通过多巴胺D2受体介导的。临床上更关心的是基础医学向临床医学的转化,多项转化医学研究结构也证实：DRD2受体特异性的激动剂可用于肿瘤治疗中的抗肿瘤血管生成和急性肺损伤后的血管内皮屏障高渗性诱发的肺水肿的治疗选择。此外,DRD2敲出的转基因小鼠(DRD2-/-)在急性肺损伤模型中,内皮细胞屏障通透性显著升高,表现为更严重的肺水肿。这一研究的报道揭示了DRD2在维持微血管屏障稳定性和通透性中的重要性。然而内源性多巴胺在这些脑微血管细胞中发挥什么样的生理功能?至今仍鲜有报道。多巴胺D2受体(DRD2),作为G蛋白偶联受体家族的一员,是抗帕金森药物的重要靶点,以改善运动障碍和抗精神失常。最近的研究表明,多巴胺受体也表达在免疫细胞和神经胶质细胞上。但是多巴胺受体在这些免疫细胞中的生理学功能仍不完全清楚。越来越多研究证实了：多巴胺D2受体激动剂在调节免疫功能和炎症反应中的保护性作用,这可能是通过抑制T细胞的增殖、活化和细胞因子分泌来实现的。此外,一种新型的同时为多巴胺D1受体的拮抗剂和D2受体的激动剂的合成药物GLC756,被证明可以抑制TNF-α从激活的肥大细胞中释放。另一种特异性DRD2激动剂,喹吡罗,在小鼠帕金森病模型上也可以抑制神经炎症、减轻神经损伤。然而,在中枢神经系统中,DRD2的表达和免疫功能在中风实验模型上还未被系统研究。值得引起注意的是,既往的报道和我们自己的前期工作都发现：多巴胺的分泌水平在ICH模型中发身后出现显著地升高。然而,这种多巴胺区域性升高的现象是否与急性脑损伤后的自我神经保护有关呢?目前仍不清楚。因此,本部分研究拟探讨内源性多巴胺系统在ICH后早期脑损伤中的代偿反应和生理意义,并进一步探索多巴胺激动剂在ICH之后治疗效应和机制,为临床转化奠定基础,为临床ICH患者救治提供可靠的新思路。材料与方法1、选择8周CD1雄性小鼠,采用基底节立体定位注入自体尾静脉血法建立小鼠脑出血模型。2、假手术组不予注射,脑出血组按照不同的时间点分为12h、d1、d3、d5、d7、六个亚组,酶免疫试剂盒和免疫印迹法(Western Blot)检测多巴胺(DA)和多巴胺受体(DRD1, DRD2)的表达曲线。运用免疫组织化学和免疫荧光染色观察脑出血后DRD1和DRD2的细胞定位和表达变化;3、使用基因敲除小鼠DRD1-/-和DRD2-/-评估ICH神经功能障碍、脑含水量、伊文氏蓝渗出量,以明确内源性多巴胺受体在维持BBB稳定性中的生理功能。4、采用L-dopa (i.p.)、D2受体激动剂Quin对ICH模型小鼠进行干预,进而评价其脑含水量、伊文氏蓝渗出量、神经功能障碍、IgG渗漏状态,以探索外源性L-dopa或D2受体激动剂在ICH后24、72小时的治疗效应。5、Western Blot检测D2受体下游信号通路中的关键分子,以探索D2受体在调控血脑屏障连接蛋白中的分子作用机制。6、在ICH术前48小时侧脑室注射CRYAB siRNA,ICH术后1小时腹腔注射Quin (5mg/kg),进而评价脑含水量、伊文氏蓝渗出量,神经功能障碍、并用Western Blot检测紧密连接蛋白分子的表达,以明确CRYAB是Quin维持ICH后BBB稳定性的重要机制。7、进一步在Quin治疗ICH前使用Gallein (G蛋白βγ亚基抑制剂)和U0126(ERK1/2抑制剂),评估伊文氏蓝渗出量,神经功能障碍和密连接蛋白分子的表达,以明确Gβγ/ERK1/2/pSer45-CRYAB是Quin在ICH后神经保护作用的分子机制。结果1、 ICH后内源性多巴胺在脑组织中显著增高,并一直持续到第7天。于此同时,多巴胺D2受体(DRD2)的表达也显著增高,波峰在ICH后72小时。免疫荧光染色显示DRD2在星形胶质细胞和内皮细胞上表达增强。2、 我们发现DRD2-/-小鼠较野生型和DRD1-/-小鼠在ICH造模24小时后,表现为显著增加的脑水肿和伊文氏蓝渗出并伴随更严重的神经功能缺损。3、L-dopa (5mg/kg)、和Quin (5mg/kg)能够显著改善ICH后脑水肿和伊文氏蓝渗出,减轻神经功能缺损和血脑屏障的破坏。4、Quin能够显著减弱ICH后血脑屏障破坏和早期脑损伤。通过对DRD2下游信号通路的筛查,发现DRD2可以显著上调CRYAB的表达和增强ERK1/2的磷酸化水平。5、进一步研究发现,用小干扰RNA抑制其CRYAB可以逆转Quin的保护作用；表现为逆转Quin对紧密连接蛋白Occludin, VE-cadherin和ZO-1的上调作用。6、Quin对CRYAB和紧密连接蛋白的上调作用可以被Gallein和U0126抵消,与此同时Gallein和U0126减弱了Quin显著改善ICH后神经功能缺损和血脑屏障的破坏的保护作用。7、DRD2及其重要的下游蛋白CRYAB在ICH后的受损的大脑半球被显著上调。8、在体沉默DRD2小鼠诱发在更严重的神经炎症反应和神经功能损伤,揭示了DRD2在ICH后胶质细胞神经炎症调节中的重要性和生理意义。9、外源性DRD2激动剂在ICH后24和72小时后对可以减轻神经损伤,减少小胶质细胞激活和炎性细胞因子(IL-1β和MCP-1)的产生。10、在体内抑制CRYAB废除Quin疗法对神经炎症的抑制作用。11、Quinpirole治疗组中CRYAB与NF-κB p65免疫共沉淀增强12、Quinpirole增强CRYAB和NF-κB之间胞质结合活性和降低的NF-κB核易位的机制。13、我们通过更简易的给药方式—经鼻腔给药,评估了喹吡罗的治疗潜力和临床转化效力。结论1.我们的研究揭示了,ICH后内源性多巴胺／DRD2受体轴在维持脑微血管稳定性中具有重要的生理功能。外源性多巴胺激动剂能够保护BBB完整性并改善神经功能预后,其机制可能与DRD2受体通过Gβγ/ERK1/2通路介导的CRYAB表达上调并进一步增强内皮细胞间隙蛋白的表达。因此,重组D2受体激动剂有可能成为改善ICH患者血脑屏障功能的可靠的新选择。2.我们的研究结果证实了,脑出血后内源性DRD2在小胶质细胞的天然免疫和神经炎症中的重要生理功能。同时,外源性DRD2激动剂治疗可抑制胶质细胞的神经炎症、减轻神经损伤,可能的机制是由促进CRYAB与NF-κB胞质结合活性而介导的。我们研究了DRD2受体激动剂在脑出血后继发脑损伤中减少神经炎症,降低神经损伤的神经保护潜能,为临床ICH的治疗提供了一个新的思路和实验室依据。