论文部分内容阅读
原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是人类严重的致盲性眼病之一。尽管目前病因尚未明确,但流行病学调查发现遗传因素在POAG的发病机制中起着重要作用。我科前期工作发现以李光洪为先证者的重庆忠县李氏POAG家系具有明显的家族聚集性、地域封闭性、遗传稳定性和临床特征性,以常染色体显性方式遗传,具有明显的孟德尔遗传特征。该家系遗传关系明确、患者人数较多、表型特征突出、同代子女较多,是理想的POAG致病基因定位研究的大型家系。本研究以重庆忠县李氏POAG家系为研究对象,对其进行了更加全面的遗传学调查和样本采集,经严格表型界定后建立永生细胞株。以短串联重复序列(short tandemrepeat,STR)为分子遗传标记,采用候选位点克隆策略结合连锁分析对该家系进行POAG候选基因及位点的筛查定位,期望发现导致该家系连续几代发病的致病基因,为丰富人类POAG易感基因谱、认识中华民族POAG的遗传背景及特点提供线索,同时为POAG发病机制的研究奠定基础。本课题进行了以下5个方面的研究:1、在前期工作的基础上,进一步补充调查了地处偏远的家系分支,完善了李氏POAG家系的遗传关系及临床资料,同时对该家系所有个体的表型特征进行了再次确认;2、为保证李氏家系成员基因组DNA(genomicDNA,gDNA)的完整性以及后续研究的顺利进行,采用EBV转化加CsA法对该家系成员B淋巴细胞进行了永生细胞株的建立与保存;3、根据OMIM已公布的POAG候选基因及位点,采用候选位点克隆策略结合连锁分析筛查李氏家系的疾病连锁区域是否与上述基因及位点重合,寻找具有显著性意义的位点,为后续工作提供线索;4、以李氏家系全部成员和30例正常对照为研究对象,对位于前一部分工作发现的D2S2259上游的CYP1B1基因的编码区域进行测序,以明确CYP1B1是否存在与李氏POAG家系“共分离”的突变位点以及CYP1B1是否为该家系的致病基因;5、加密D2S2259附近的STR markers,继续行基因分型和连锁分析,寻找具有显著性意义的连锁位点,进一步缩小李氏家系致病基因的连锁区域。主要结果和结论如下:1.重庆忠县李氏POAG家系的遗传方式属于常染色体显性遗传,共7代50余人,现存4代34人,截至2006年2月有POAG患者11例,男8例,女3例。该家系患者发病年龄均≤40岁(男性平均26.5岁,女性平均32.7岁),且发病时IOP高(发病时均感眼胀痛难忍,多伴随“虹视”现象,有条件测量IOP者均>21mmHg),视神经严重损害(视盘垂直C/D多接近1.0),视功能重度丧失(多表现为晚期青光眼视野缺损和视觉电生理检查异常),是一个遗传关系明确、患者人数较多、表型特征突出、同代子女较多的大型POAG家系。2.用EBV转化加CsA法对李氏家系34位成员的B淋巴细胞进行永生细胞株的建立与保存,建株成功率为91.2%(31株),复苏成功率为87.1%(27株),复苏失败的4株均源自高龄个体。实验结果显示该建株方法操作简单,结果可信,成功率高,有效保存了该家系的遗传资源。3.获得李氏家系34位成员的gDNA:源自永生细胞株11例、外周血20例、唾液3例。经质量评定,所提gDNA的质量均能满足后续研究的要求。采用候选位点克隆策略结合连锁分析,选择与青光眼发病相关的代表MYOC、OPTN、WDR36和CYP1B1的8个STR marker进行筛查定位。结果显示:位于CYP1B1附近的D2S367和D2S2259的两点最大LOD值具有显著意义,特别是D2S2259,不论是LOD值(2.135)还是重组率θ(0.06),都已达到Lander和Kruglyak于1995年提出的标准(LOD≥2.1,θ<0.10),提示D2S2259与李氏家系的致病基因连锁;这一结果也排除了该家系与MYOC(1q21-q31)、OPTN(10p15-p14)和WDR36(5q22.1)三个基因连锁的可能性。4.对34位李氏家系成员和30例正常对照进行CYP1B1编码区域的测序,在李氏家系的5例患者和1例正常一级亲属中发现342 G/C、441 G/A、494 G/C、1720 C/A、1933 G/C、2087 G/A和2198-2199 CT del共7处杂合突变,其余患者或亲属未检测到任何突变。来自同一地区的正常对照未发现上述任何突变。该家系CYP1B1编码区域的突变频率为17.65%,患者为45.45%,正常一级亲属为4.35%。测序结果表明CYP1B1编码区域的突变与李氏家系发病相关,但并非直接导致该家系连续多代发病的真正原因。5.通过加密D2S2259连锁区域的STR markers并连锁分析,发现D2S2369、D2S2352、D2S378和D2S337的LOD值和θ值具有显著意义(D2S2369:LODs=4.584.θ=0.00;D2S2352:LODs=2.992,θ=0.00;D2S378:LODs=6.238,θ=0.00;D2S337:LODs=4.892,θ=0.00),提示由这4个STR markers确定的染色体区域与重庆忠县李氏POAG家系的致病基因紧密连锁。该区域位于2p15～2p16.3,长约7cM/7.5Mb,共有12个基因在眼部表达。本研究所定位的李氏家系POAG致病基因所在区域2p15～2p16.3与2007年Suriyapperuma SP等人对7个成人型POAG家系的定位区域一致,且范围更小。