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肝癌是全球最常见的癌症之一,位居癌症死亡人数第二。肝脏有极强的再生能力,在受到损伤或部分肝切除后,处于静止期的肝细胞会迅速进入细胞周期进行增殖,但当残肝恢复到原肝的细胞数量后,细胞即由细胞周期进入G0期。可见,肝癌形成和肝再生中细胞增殖必不可少,两者基因作用的差异方面很值得研究。本研究应用包括时间序列分析,权重基因共表达网络分析(Weight gene co-expression network analysis,WGCNA),生理功能富集和基于蛋白互作网络的功能富集空间分析(spatial analysis of functional enrichment,SAFE)等生物信息学方法对大鼠2/3肝切除后的肝再生过程(包括0 h、2 h、6h,12 h、24 h、30 h、36 h、72 h、120 h、168 h等10个时间点)及丙型肝炎引起的肝细胞癌发生过程(包括肝硬化、异型增生、肝癌极早期、肝癌早期、肝癌晚期、肝癌终末期等6个病理阶段)的基因表达数据特别是两者的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)数据进行分析,找出两者关键基因的相同和差异,探讨导致两者细胞增殖行为的差异的途径和方式,为揭示支配正常细胞增殖和异常细胞增殖的分子机制,提供思路和方法。本论文的研究成果包括:1.在肝再生研究方面,找出了决定肝细胞正常增殖的关键基因及其作用机制。其中,(1)WGCNA构建的基因共表达网络和蛋白互作网络都显示以细胞增殖为代表的blue模块在肝再生过程的主导地位。同时蛋白互作网络也显示了cyan模块,magenta模块,green及greenyellow模块等在肝再生中的重要作用。通过对已知的肝再生相关基因在蛋白互作网络中的定位发现,其主要map到上述模块,另外,hub-bottlenecks基因也是倾向性的分布于上述模块。(2)通过对大鼠肝再生10个时间点基因表达数据进行三元回归分析发现,肝再生过程中有一个重要的时间转折点大概在45 h左右,这是肝再生增殖阶段第二个细胞周期的S期前后。大鼠肝切除后细胞增殖活动先于72 h已经完成,随后,胞外基质重建,血管生成和脂类代谢相关基因表达升高,这与能量和细胞成分的大量需求有直接的关系。(3)对差异表达基因进行小鼠表型富集分析发现,大鼠肝再生过程中伴随着脑萎缩和性器官发育不良等,这可能是肝脏切除之后对能量的重新分配引起。(4)通过对WGCNA得到的hub基因,基于所有已知肝再生相关基因和DEGs之间的网络构建得到的hub-bottlenecks基因和关键模块所有基因与肝再生基因的功能相似性得分的分析,筛选得到未报道的肝再生中的关键基因有Fyn、Polr2c、Impdh2、Cav1、Ran、Cdk2、Hsp90aa1、Rrm1、Insr1、Cdc45、Vim、Nrp1并在小鼠肝再生中进行验证。其作用机制是通过调控G1/S检查点使静止期肝细胞在大鼠肝切除后进入细胞周期。(5)基于具有相似的表达模式的基因很可能参与同一生理途径或受同一转录因子调控的假设,筛选出包括PU1、ELK1、E2F1、E2F4、NRF1和KTGGYRSGAA_UNKOWNUSF、在内的转录因子,miR-24、miR-29a,b,c在内的microRNA和潜在的未知功能的包括LOC100911575和RGD15619在内的未知功能的基因。2.在肝癌形成研究方面,找出了决定肝癌细胞异常增殖的关键基因及其作用机制。其中,(1)运用masSigPro和WGCNA对肝癌发生中6个病理阶段的基因表达谱数据进行时间序列分析发现,从肝脂肪肝到肝癌终末期转移过程中,基因表达变化最显著的是异型增生结节到肝癌早期阶段,也就是癌变开始发生时。(2)以细胞增殖为代表的brown_c56模块的基因在肝癌形成中的变化非常明显,所含基因在蛋白互作网络中形成一个核心区域。其次是brown_c12模块和red模块,已知肝疾病相关基因(包括肝硬化,肝异型增生,肝癌浸润和转移)主要集中到上述模块中。hub-bottlenecks基因集中分布于细胞增殖模块,提示肝癌的发生发展过程和细胞增殖的关系最为密切。(3)肿瘤阶段伴随着脂肪酸β-氧化和三羧酸循环相关基因表达的降低,提示在肿瘤阶段细胞能量的供应方式发生了改变,这可能是因为肿瘤细胞的快速增殖需要快速的能量供应或快速增殖导致的氧气缺乏不得已而采取的能量获取方式。(4)通过对WGCNA得到的hub基因,基于所有已知肝疾病相关基因和DEGs之间的网络构建得到的hub-bottlenecks基因和关键模块所有基因与肝癌相关基因的功能相似性得分的分析,筛选得到肝癌发生中的关键基因有FYN、GYS2、CENPF、CCNB2、KIF4A、H2AFV、BUB1、H2AFZ、DCN、TOP2A、RRM2、HSP90AB1、XPO1并在肺鳞癌和胰腺癌中进行了验证。其作用机制是通过调控G2/M检查点来调控细胞周期。(5)基于具有相似的表达模式的基因很可能参与同一生理途径或受同一转录因子调控的假设,筛选出包括USF、MAX、E2F1,4、NRF1、YY1和KTGGYRSGAA_UNKOWN在内的转录因子,hsa-miR-24和has-miR-208a在内的micro-RNA和潜在的未知功能的包括FAM72A、CDC124、CNOT11、MIR1244-1在内的未知功能的基因。3.在肝再生和肝癌细胞发生中细胞增殖行为差异研究方面,找出了决定肝细胞正常增殖和异常增殖的关键基因作用途径和方式差异。其中,(1)由biomaRt包对大鼠肝再生和人肝癌动态变化中差异基因的同源性匹配结果比较发现,大鼠肝再生中的849个差异基因匹配到人类同源基因去重复后共830个,其中共有基因119个,大鼠种族特有基因12个。肝癌发生发展过程中1047个差异基因匹配到大鼠同源基因去重复后共计892个,其中共有基因104个,人类种族特有基因25个。(2)肝再生和肝癌动态发生过程中筛选出的差异基因的总体变化趋势不同。肝再生中DEGs转录表达值回归至起始点,而肝癌中则背离起始点。这种微观上表达谱的变化和宏观上表型的变化(肝再生回至肝切除起点,而肝癌发生终末期转移)十分一致。(3)细胞增殖是肝再生和肝癌发生中共有的最显著失调的过程。细胞增殖相关基因的表达模式在肝再生中的增殖阶段与肝癌形成中异型增生结节到肝癌早期的转变阶段相似。(4)肝再生和肝癌发生中增殖相关关键基因分别通过调控细胞周期的不同检查点来调控细胞增殖过程。其中,肝再生通过CDC45、CDK2、HSP90AA1、MCM2-3、MCM5-7、NCAPD2、POLD1、RAN、RPA2、RRM1-2、SUGT1等关键基因调控G1/S检查点使静止期肝细胞在大鼠肝切除后重新进入细胞周期,肝癌发生主要通过AURKA、BIRC5、CCNA2、CCNB2、CDK1、CENPF、FOXM1等关键基因调控G2/M检查点来调控细胞是否进入有丝分裂期。(5)通过对肝再生和肝癌发生中关键基因的对比分析,筛选出FYN、XPO1、FOXM1、EZH2、CENPF等关键基因属于者共有的关键基因。其中FYN作为在肝再生(上调)和肝癌的增殖过程(下调)表现相反表达模式的基因,可能在两者中通过分别结合不同的上游因子RTKs和TSP1/CD36,从而分别启动细胞增殖和细胞凋亡过程进行调控。上述结果表明,肝再生中对细胞增殖的关键调控点是细胞周期的G1/S检查点,起关键作用的基因有CDC45、CDK2、HSP90AA1、MCM2-3、MCM5-7、NCAPD2、POLD1、RAN、RPA2、RRM1-2、SUGT1等。肝癌发生中对细胞增殖的关键调控点为细胞周期的G2/M检查点,起关键作用的基因有AURKA、BIRC5、CCNA2、CCNB2、CDK1、CENPF、FOXM1等。并且FYN、XPO1、FOXM1、EZH2、CENPF等可能共同调控了肝再生和肝癌两种不同的生理过程。