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对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是一种使用非常广泛的解热镇痛类药物。不合理用药和一些偶然因素作用下,服用APAP会导致肝脏损伤,肝脏损伤严重者甚至可能会发生急性肝衰竭。APAP诱导的肝细胞死亡与细胞抗氧化系统紊乱导致的脂质过氧化物过度产生有关。铁死亡(ferroptosis)是依赖于铁与氧化应激相关细胞的死亡方式,其不同于经典细胞死亡,如凋亡和坏死。铁死亡有独特的形态学特征,其主要包括线粒体嵴溶解和线粒体轮廓变小等。此外,脂质过氧化物在细胞内积聚是铁死亡发生的直接因素。细胞内铁离子和活性氧所介导的芬顿反应(Fenton reaction)进一步促进脂质过氧化物在细胞内积聚。铁离子螯合剂能明显抑制铁死亡。APAP诱导而受损的小鼠肝脏存在大量脂质过氧化物的积累,并伴随着细胞内铁的蓄积,近来研究发现铁死亡在其中发挥重要作用。褪黑素(melatonin)是松果体产生的一种高效的抗氧化物质。褪黑素具有直接和间接的抗氧化和自由基清除的生物活性。褪黑素可以抑制肝损伤和肝细胞氧化应激,提高APAP诱导的肝损伤小鼠生存能力,但机制研究还不透彻。本课题旨在研究褪黑素对APAP诱导的肝细胞死亡进程中对铁死亡这一过程的影响。1.本研究首先考察了褪黑素对APAP肝损伤小鼠的保护作用。使用C57BL/6J小鼠和400 mg/kgAPAP建立APAP肝损伤模型。从肝功能与病理学损伤和过氧化指标方面检验褪黑素的肝脏保护作用,然后探讨褪黑素是否通过铁死亡途径发挥肝脏保护作用。以铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)作为阳性药物,设置正常对照组、APAP模型组、Fer-1(5 mg/kg)组以及褪黑素高(100 mg/kg)、低剂量(25 mg/kg)组。褪黑素与Fer-1的给药方式分别为灌胃和腹腔注射。(1)采用小鼠血清转氨酶(ALT和AST)为肝功能指标检测肝脏损伤程度。结果发现,相比于正常组,APAP组的ALT和AST水平显著上升(P<0.01,P<0.01);相比于APAP组,高低剂量褪黑素组的ALT和AST水平显著降低(P<0.01,P<0.05;P<0.01,P<0.05);相比于 APAP 组,Fer-1 组 ALT 和AST水平显著降低(P<0.05,P<0.05)。该结果表明褪黑素对APAP诱导小鼠ALI有显著的保护作用。(2)分别采用H&E和TUNEL染色法检测小鼠肝组织损伤的病理学特征。结果发现,APAP诱导ALI模型小鼠的肝脏组织出现明显坏死、出血等病理特征,而高和低剂量褪黑素均能很好缓解这些病理损伤;Fer-1也同样缓解这些病理损伤。(3)采用微板法分别检测了肝脏丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽(GSH)水平,以评估肝脏过氧化状态。结果发现,APAP诱导的C57小鼠肝脏组织中MDA水平明显上升(P<0.01),同时显著耗竭肝脏GSH(P<0.01),而高和低剂量褪黑素均能明显降低MDA水平,同时能明显提高GSH水平(P<0.05,P<0.05;P<0.05,P<0.05);相比于APAP组,Fer-1也能显著降低MDA水平,同时显著提高肝脏GSH水平(P<0.05,P<0.05)。(4)采用RT-PCR检测了铁死亡的生物标志--前列腺素内过氧化物合成酶2(Ptgs2)mRNA水平急剧升高。结果发现,APAP诱导的肝脏组织内Ptgs2 mRNA含量明显上升(P<0.01)。相比于APAP模型组,高和低剂量褪黑素组均能明显降低Ptgs2 mRNA水平(P<0.01,P<0.01);相比于APAP模型组,Fer-1组也能明显降低肝脏Ptgs2 mRNA水平(P<0.05)。(5)采用透射电镜观察了 C57小鼠肝细胞线粒体的铁死亡相关特征结构变化。结果发现,APAP诱导的ALI小鼠肝脏组织中出现典型的铁死亡相关细胞线粒体病理性改变,包括线粒体明显增大和线粒体嵴损伤等;对于高、低剂量褪黑素组铁死亡相关线粒体的病理改变有显著改善;Fer-1同样改善了线粒体病理变化。以上结果表明,400mg/kg APAP诱导的C57小鼠肝脏发生铁死亡,褪黑素与铁死亡选择性抑制剂Fer-1均可以抑制APAP诱导C57小鼠肝细胞铁死亡,从而发挥保护肝脏的作用。2.采用APAP的HepaRG肝细胞铁死亡模型,进一步考察了褪黑素对该肝细胞毒性的保护作用。(1)采用细胞存活率分析(CCK-8法)的方法筛选确立Fer-1对APAP诱导HepaRG铁死亡的最佳保护浓度。结果发现,DFO在20 μM、Fer-1在1 μM,褪黑素在50 μM分别对10 mM APAP对HepaRG肝细胞损伤有显著的保护作用;。(2)在此基础上,检测MDA以考察该模型HepaRG细胞内脂质过氧化物的积聚情况,以探讨褪黑素对肝细胞的保护作用以及对铁死亡的影响。结果发现,经过10 mMAPAP处理的HepaRG细胞脂质过氧化物含量显著升高(P<0.01),褪黑素明显降低HepaRG细胞脂质过氧化物水平(P<0.05);Fer-1同样明显降低HepaRG细胞脂质过氧化物水平(P<0.05)。这些结果表明褪黑素对APAP诱导的肝细胞铁死亡有显著的抑制作用。3.采用APAP诱导小鼠ALI模型,以铁离子螯合剂--去铁胺(Deferoxamine,DFO)为阳性对照药物。24只小鼠分别四组,包括正常对照组、APAP模型组、褪黑素组以及DFO组,每组6只。探讨褪黑素抑制铁死亡所涉及的信号通路,以明确褪黑素激活的抗氧化通路是否参与APAP诱导的肝细胞铁死亡。(1)采用RT-PCR检测了铁死亡相关抗氧化因子,包括C57小鼠肝脏核转录因子E2相关因子2(NF-erythroid2-related factor2,Nrf2)、血红素氧合酶1(Heme oxygenase-1,HO-1)和还原型的醌氧化还原酶 1(NAD(P)H quinone oxidoreductase,NQO1)的mRNA水平。结果发现,相比于正常组,APAP诱导的ALI模型组Nrf2和NQO1均未明显改变(P>0.05,P>0.05);比于正常组,APAP诱导的ALI模型组HO-1明显降低(P<0.05);褪黑素明显提升APAP模型组小鼠肝脏Nrf2(P<0.05)、HO-1(P<0.05)和NQO1 mRNA的表达(P<0.01);DFO明显提升APAP诱导的ALI模型小鼠肝脏Nrf2(P<0.05)、HO-1(P<0.05)和 NQO1 mRNA 的表达(P<0.05)。(2)采用免疫组化分别检测各组C57小鼠肝脏总Nrf2和HO-1蛋白的相对表达。检测结果发现,与正常组相比,APAP模型组C57小鼠肝脏的总Nrf2和HO-1的蛋白表达没有明显差异(P>0.05,P>0.05),而褪黑素能明显提升Nrf2和HO-1的蛋白表达(P<0.05,P<0.05)。DFO也具有相同的作用。(3)采用RT-PCR检测了 ACSL4通路,结果发现相比于正常组,APAP模型组ACSI4 mRNA没有明显差异(P>0.05);相比于APAP模型组,褪黑素组和DFO组均没有明显差异(P>0.05,P>0.05),说明400mg/kg APAP导致肝损伤可能与脂质代谢通路无关。总之,本课题的研究表明,褪黑素通过抑制铁死亡机制发挥对APAP诱导肝损伤的肝脏保护作用;褪黑素还通过激活Nrf2、NQO1和HO-1通路抑制APAP导致肝脏氧化应激引发的铁死亡,进一步缓解肝损伤。本课题的这一发现对APAP介导肝损伤的机制有了更深入的认识,并对褪黑素通过铁死亡途径发挥肝保护作用提供了理论支持。