麦芽中真菌毒素的电化学免疫传感器检测新方法的建立及LC-MS/MS检测研究

来源 :锦州医科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:tmgt2009
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目的受基质本身及外在因素的影响,中药材在生长、采收、加工、储藏和运输过程中极易霉变而污染真菌毒素,影响药材质量和安全,威胁使用者的身心健康。其中,黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是中药材中检出率和污染水平较高的两种真菌毒素,且具有较强的肝肾毒性和致癌、致畸、致突变等作用。杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin,ST)作为AFB1的前体物质,对AFB1的产生和残留具有较好的预示作用。所以,阐释中药材中ST与AFB1的产生关系,并建立灵敏可靠的分析方法快速检测中药材中真菌毒素的污染水平,对保证药材质量和安全具有重要意义。因此,本课题以“药食两用”麦芽为研究对象,考察其在储藏过程中ST与AFB1的产生关系,并建立灵敏的电化学方法快速检测麦芽中OTA的污染水平,为中药材中真菌毒素的监测提供技术支撑和理论依据。方法由于ST是AFB1前体物质,运用反式培养技术研究染菌与细菌生长最佳条件下AFB1生长情况与ST之间的关系。取生麦芽分两批培养20天,每隔两天取样打粉。并对样品提取溶剂,前处理方法,液相流动相比例进行优化,在最优条件下建立LC-MS检测方法进行检测,进而研究ST与AFB1之间生长关系。基于自组装原理运用巯基乙酸(Thioglycolic acid,TGA)制备自组装膜,并分别利用循环伏安法(Cyclic voltammetry,CV)和电化学阻抗法(Electrochemical impedance spectrum,EIS)对自组装膜(Self-assembly,SAM)进行表征。对自组装膜偶联时间、最佳浓度、偶联温度进行优化,最终获得稳定自组装膜最佳条件。利用制备的Au/TGA自组装膜,偶联牛血清白蛋白结合的OTA抗原(Bovine serum albumin-Antigen,BSA-Ag),对其最佳时间、最佳浓度和最优温度进行考察,最后优化Au/TGA-BSA/Ag偶联抗体(Antibody,Ab)最佳偶联时间、浓度。在最优条件下建立Au/TGA-BSA/Ag-Ab电化学免疫传感器,并对OTA进行检测,建立标准曲线,进行麦芽样品加标回收检测。结果本研究确定了AFB1和ST在液质中的最佳流动相为含0.1%甲酸和5 mM乙酸铵的水溶液(A相),含0.1%甲酸的甲醇溶液(B相),建立了AFB1和ST的标准曲线:AFB1在0.1-50 ng/mL范围内,线性方程为y=55600x-1600(r=0.9999),检出限为0.03 ng/mL;ST在0.25-100 ng/mL范围内,线性方程为y=64600x+4210(r=0.9993),检出限为0.04 ng/mL。实验表明在麦芽产菌过程中ST含量与AFB1含量成正比。确定了Au/TGA最佳自组装膜的条件为:在温度为4℃,TGA的浓度为4mmol/L,与金电极偶联时间为90 min时,TGA在金电极上形成稳定的单分子膜。接着利用已建立的Au/TGA自组装膜,确定了Au/TGA-BSA/Ag-Ab传感器的最佳实验条件:在温度为37℃,EDC/NHS浓度比为2:1,活化时间20 min时,对Au/TGA活化效果最佳;然后偶联BSA-Ag,其最佳偶联条件为200μg/mL、45 min和25℃;最后偶联抗体,其最佳偶联条件为200μg/mL,偶联4h。应用在最佳条件下得到的Au/TGA-BSA/Ag-Ab传感器,建立OTA标准溶液的标准曲线,在OTA浓度范围为0.1-1 ng/mL,线性方程为y=0.2219x+0.1888(r>0.99)检出限为(LOD)0.08 ng/mL。并对麦芽样品进行加标回收,OTA的回收率为71.8-97.1%,RSD值小于3%,符合实验要求。结论本实验表明当ST含量达1μg/kg以上时,AFB1含量严重超标,监测ST含量对有效控制AFB1含量至关重要。利用Au/TGA自组装膜建立Au/TGA-BSA/Ag-Ab免疫传感器对麦芽基质进行检测重现性、稳定性和特异性良好,具有良好应用前景。
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