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背景淋巴瘤(Lymphoma)是淋巴细胞来源的淋巴造血系统的恶性疾病。依据肿瘤细胞及组织的病理类型,可主要分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)两类型。结外NK/T细胞淋巴瘤(extranodal NK/T cell lymphoma,ENKTCL)作为非霍奇金淋巴瘤的一个特殊的亚型,具有独特的流行病、病理和临床特点。其在欧美国家罕见,而在东亚及拉丁美洲常见,中青年男性发病率高。肿瘤常常累及淋巴结外,鼻咽部常见,其他部位如腭部、扁桃体、咽喉等上呼吸消化道可见,非上呼吸消化道如肺、皮肤、睾丸等罕见。其侵袭性强,病程进展快,预后极差。研究显示其病因与EB病毒感染相关,国际尚无明确的标准治疗方案。常规非霍奇金淋巴瘤治疗方案,如含阿霉素的CHOP方案可使细胞耐药导致效果不佳,近年来含门冬酰胺酶、吉西他滨等药物的治疗方案展现出一定的效果,但仍有部分患者表现为复发难治。探索ENKTCL耐药机制对提高患者疗效、改善患者生存具有重要作用,使得对其研究迫在眉睫。近年来,“种子(肿瘤)与土壤(微环境)”学说愈发引起关注。微环境通过与肿瘤细胞的相互作用,促进细胞的增殖、躲避及耐受有害刺激,导致肿瘤的形成和耐药。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)作为微环境中细胞因子的重要一员,在肿瘤的形成及抑制中均表现出一定作用。TNF-α是最早发现的细胞因子,由活化的巨噬细胞分泌产生,在炎症中发挥重要作用。目前对于TNF-α的研究多在自身免疫性疾病领域,如类风湿关节炎、强制性脊柱炎和炎症性肠病等,针对肿瘤的研究少见。最新研究显示TNF-α联合阿霉素可抵抗乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/Adr的耐药作用,并且提高乳腺癌放化疗疗效。我们的前期研究证实TNF-α在结外NK/T细胞淋巴瘤患者血清中较正常人明显降低,提示其可能为ENKTCL的保护性因素。关于TNF-α在ENKTCL耐药中的作用,尚未有研究报道。NF-κB通路作为近年来研究的热点通路,其激活与炎症及肿瘤密切相关,主要通过经典途径和旁路途径激活NF-κB蛋白,转入胞核结合靶基因中的启动子或增强子,诱导相关基因的转录和表达,在NK/T细胞淋巴瘤耐药中可能发挥着重要的作用。本实验以NK/T细胞淋巴瘤细胞株YTS为研究对象,采用低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法建立耐吉西他滨(Gemcitabine,Gem)的YTS细胞系(YTS/Gem),在Gem及TNF-α两因素作用下,分别采用CCK8、细胞流式及Western blot方法对比YTS及YTS/Gem细胞增殖、周期变化及相关蛋白表达情况,初步探索TNF-α在结外NK/T细胞淋巴瘤耐药中发挥的作用。目的以NK/T细胞淋巴瘤细胞株YTS为研究对象,建立耐吉西他滨(Gemcitabine,Gem)的YTS细胞系(YTS/Gem),对比YTS及YTS/Gem在Gem及TNF-α两因素作用下细胞增殖、周期变化及相关蛋白表达情况,探索TNF-α在结外NK/T淋巴瘤耐药中作用。方法1.细胞的体外培养:YTS细胞以1640培养基中加入10%胎牛血清为培养液;YTS/Gem细胞以1640培养基中加入10%胎牛血清及一定浓度的Gem为培养液。每2-3天对细胞更换或者添加适量培养液,置于培养箱,适宜条件(37℃、5%CO2)下培养。2.YTS/Gem细胞的构建:对YTS细胞使用Gem低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导其产生耐药,建立可稳定传代的耐Gem的YTS细胞株(YTS/Gem)。3.耐药指数的测定:在96孔板中以不同浓度Gem(0、5、10、20、40、80nM)处理YTS细胞和YTS/Gem细胞,设3个复孔;采用CCK8法,利用酶标仪测定波长在450nm时的吸光度,获得相应OD值,计算YTS细胞和YTS/Gem细胞的IC50值,重复测量三次,求得YTS/Gem细胞的耐药指数。4.实验分组:对YTS、YTS/Gem细胞,分别进行如下实验分组:(1)对照组:将YTS细胞或YTS/Gem细胞在培养液中培养48h;(2)TNF-α组:将YTS细胞或YTS/Gem细胞在含TNF-α20ng/ml浓度培养液中培养48h;(3)Gem组:将YTS细胞或YTS/Gem细胞分别在含Gem 20nM浓度培养液中培养48h;(4)Gem+TNF-α组:将YTS细胞或YTS/Gem细胞在含TNF-α20ng/ml浓度及Gem20nM浓度培养液中培养48h。5.细胞增殖的检测:采用CCK8法,在96孔板分设3个复孔,利用酶标仪测定波长在450nm时的吸光度,获得相应OD值,比较YTS细胞及YTS/Gem细胞在TNF-α组、Gem组及Gem+TNF-α组增殖活性的改变。6.Western blot法检测相关蛋白:对YTS和YTS/Gem细胞的对照组、TNF-α组、Gem组及Gem+TNF-α组分别检测NF-κB通路中磷酸化NF-κB(p-p65)蛋白、总NF-κB(p65)蛋白表达情况。7.流式细胞技术检测细胞周期:对YTS/Gem细胞,使用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)比较TNF-α组、Gem组及Gem+TNF-α组细胞周期的改变。8.使用SPSS 17.0软件进行统计学分析和绘图,数据均用平均值±标准差(sx±)显示。两组不同数据比较如果其方差齐,使用t检验,如方差不齐,使用t’检验。多组不同数据间的比较即选取单因素方差方法分析,多样本不同均数其两两比较即采用LSD-t检验。p<0.05表示差异具有显著的统计学意义。结果1.成功构建了NK/T细胞淋巴瘤细胞的吉西他滨耐药株YTS/Gem。吉西他滨对YTS细胞和YTS/Gem细胞的IC50值分别为(18.09±1.67)nM和(314.90±5.62)nM,YTS/Gem细胞株耐药指数达到了17.41。2.TNF-α促进YTS/Gem细胞的增殖:(1)在TNF-α作用下,TNF-α组与对照组相比,TNF-α对YTS细胞作用不明显(p>0.05),却使YTS/Gem细胞存活率提高(p<0.05)。(2)在TNF-α与Gem作用下,Gem+TNF-α组与Gem组相比,TNF-α对YTS细胞作用不明显(p>0.05),却使YTS/Gem细胞存活率提高(p<0.05)。3.TNF-α使YTS/Gem细胞的NF-κB通路激活:在YTS/Gem细胞中,TNF-α组与对照组相比,TNF-α使磷酸化NF-κB(p-p65)蛋白表达增高,而总NF-κB(p65)蛋白表达无明显变化;Gem+TNF-α组与Gem组相比,TNF-α使磷酸化NF-κB(p-p65)蛋白表达增高,而总NF-κB(p65)蛋白表达无明显变化。4.TNF-α对YTS/Gem细胞周期无影响:在YTS/Gem细胞中:TNF-α组与对照组相比,TNF-α使G0/G1期细胞比例减少、S期细胞比例增多,差异无统计学意义(p>0.05);Gem+TNF-α组与Gem组相比,TNF-α使G0/G1期细胞比例减少、S期细胞比例增多,差异无统计学意义(p>0.05)。结论1.成功构建针对吉西他滨的NK/T细胞淋巴瘤耐药细胞株YTS/Gem。2.TNF-α通过上调NF-κB通路促进NK/T细胞淋巴瘤耐药细胞株YTS/Gem的增殖,进而调控其耐药的发生。