目的：利用全骨髓细胞培养系，研究M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3对体外诱导培养的破骨细胞形成及分化的影响，探讨三种细胞因子间相互作用及协同作用，为进一步研究破骨细胞及合理选用细胞因子提供依据。　　 方法：选用4周龄SD雄性大鼠（体重80-120g），利用全骨髓细胞培养系，进行体外破骨细胞诱导培养，观察M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3对破骨细胞形成及分化的影响，同时比较三种细胞因子的作用。　　 1.细胞培养及细胞因子添加：　　 1.1 全骨髓细胞培养：取4周龄SD雄性大鼠一只(80-120g)，异氟烷麻醉后，无菌条件下取其股骨和胫骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔，用10ml无菌注射器抽取不含胎牛血清的α-MEM培养液冲洗骨髓腔，收集全骨髓细胞，将所提取的细胞悬液充分吹打至没有细胞团块后，置于离心机内离心5分钟（1500转/分），弃去上清液，加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，用细胞计数板计算细胞数，计算出细胞原液浓度，然后配制浓度为2×106cells/ml的细胞悬液，加入青霉素100单位/ml和链霉素100ug/ml。将细胞播种于24孔培养板（4行6列）中，每孔加入浓度为2×106cells/ml的细胞悬液0.5ml。　　 1.2 细胞因子的添加：24孔培养板第一列为对照组，不添加任何药物：第二列加入1,25-(OH)2D3(1×10-8Mol/ml);第三列加入1,25-(OH)2D3+RANKL(1,25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+RANKL20ng/ml）；第四列加入1,25-(OH)2D3+M-CSF(1，25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+M-CSF20ng/ml);第五列加入1,25-(OH)2D3+M-CSF+RANKL(1,25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+M-CSF20ng/ml+RANKL20ng/ml);第六列加入RANKL+M-CSF(RANKL20ng/ml+M-CSF20ng/ml)。　　 1.3 细胞培养：细胞因子添加完毕后将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养至第4天时更换培养液一次，共培养7天。　　 2.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：培养至第7天后行TRAP染色，倒置光镜下观察，计算3核以上染色阳性细胞数。　　 3.统计学分析：使用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据处理采用非参数检验的方差分析和S-N-K检验。　　 结果：　　 1.破骨细胞的形态学特征培养前三天各组均未见破骨细胞形成，培养第五天开始实验组可见少量破骨细胞形成，培养至第七天实验组破骨细胞已经分化成熟，而对照组始终没有破骨细胞的形成。对全骨髓细胞培养进行TRAP染色后，光镜下可见到大量成熟的破骨细胞，其形态学特征为：细胞体积较大，呈椭圆形、漏斗形、油煎蛋样、条索状或不规则形。细胞浆丰富呈紫红色，细胞核较大，数目达几个甚至多达几十个，核仁清晰，细胞浆内可见空泡结构。　　 2.M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3对破骨细胞的形成和分化均具有促进作用，多因子比单因子和双因子在相同条件下形成的破骨细胞数目多。全骨髓培养系中，培养板第一列（对照组）没有添加细胞因子，最终没有破骨细胞的形成；第二列加入1,25-(OH)2D3形成了破骨细胞，证明1,25-(OH)2D3对破骨细胞的形成和分化具有促进作用；第三列、第四列除加入1,25-(OH)2D3外，还分别加入了RANKL和M-CSF，最终都有破骨细胞的形成，并且形成破骨细胞的数目较第二列多，与第二列相比统计学有显著性差异(P＜0.05)，说明RANKL和M-CSF对破骨细胞的形成和分化也具有促进作用，但第三、四列间无显著性差异(P＞0.05)；第五列同时加入M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3后形成的破骨细胞数目最多，说明三种细胞因子对破骨细胞形成和分化具有协同促进作用，与第二、三、四、六列比较，有显著性差异(P＜0.05)。第六列只加入RANKL和M-CSF后也形成了破骨细胞，但数量和第三、四列相似（见表1、直方图）。　　 结论：　　 1.M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3对破骨细胞的形成和分化均具有促进作用。　　 2.单因子和双因子间对破骨细胞形成和分化有显著性差异。　　 3.三种细胞因子共存在对破骨细胞形成和分化具有协同促进作用。