前言肝硬化是各种慢性肝病的终末期表现,目前尚无特别有效的治疗方法,对其治疗方法的研究一直处于不断的探索之中。肝移植因其能够较好地改善肝功能、延长肝硬化患者的生存期,已成为较理想的治疗选择,然而由于其治疗费用昂贵、供肝数量有限以及伦理道德等方面的问题,又限制了其在临床上的广泛应用,因此,探索和寻找一种经济易行、又无供求限制的新方法,已成为目前研究的热点。近年来,随着对干细胞研究的不断深入,特别是骨髓干细胞具有的多向分化潜能及超强的可塑性逐渐受到重视,部分领域在临床已得到初步应用,如心肌缺血、糖尿病,肝病等。基础研究表明骨髓干细胞在体外诱导培养时可转化为功能成熟的肝细胞,在活体实验中骨髓干细胞可在肝损伤和肝纤维化的环境内存留、生长和转化,改善肝功能。在目前肝病的干细胞治疗实验研究中大多采用大鼠四氯化碳(CCL4)诱导的肝硬化模型,其采用的异体干细胞移植与局部注射移植方法离临床实用有很大差别,而大动物的肝硬化模型尚不成熟。目前骨髓干细胞移植在肝脏疾病治疗的实验研究中,已经证明骨髓干细胞对肝损伤和重症肝病较好的治疗效果,但对肝硬化似乎不很理想,因此探索增强干细胞移植对肝硬化治疗效果的方法非常必要。本研究从中等动物兔肝硬化模型和肝损伤模型中,利用自体骨髓干细胞作为种子细胞,采用临床最方便、实用的经肝动脉途径的移植方法进行实验研究,通过对肝功能的跟踪检测和动物肝脏组织病理对照观察,来评价骨髓干细胞移植对肝损伤和肝硬化治疗的安全性及有效性。并用促肝细胞生长素作为干扰因素探索提高骨髓干细胞对肝硬化治疗效果的方法。实验目的探索应用四氯化碳制作兔急性肝损伤及肝硬化模型的方法,评价该方法的可行性和制模成功率。材料与方法雄性新西兰大白兔70只,分成3组:正常对照组(10只)、急性肝损伤模型组(15只)、肝硬化组(45只),急性肝损伤组每只每日皮下注射50%CCL4橄榄油溶液0.8ml/kg,连续注射4天,第7天检测肝功能及肝脏病理。肝硬化组给予皮下注射注射50%CCL4橄榄油溶液0.2ml/kg,每周2次,12周后检测肝功能及肝脏病理。对照组分两组分别按相同剂量和时间给予皮下注射橄榄油溶液。实验结果1.兔急性肝损伤模型组:在四氯化碳注射4天后,化验肝功能明显改变,肝酶活性显著升高,谷丙转氨酶由35.83±8.04u/l上升至331.00±29.15u/l,总胆红素由6.41±0.52umol/l上升至11.64±0.58 umol/l。病理可见大面积肝细胞肿胀、坏死、并可见脂肪变性、肝组织结构紊乱,炎性细胞浸润明显。模型制备成功率为100%。2.肝硬化模型组:在四氯化碳注射12周后,肝功能检查部分指标变化明显,白蛋白由40.28±2.30g/l减少至27.46±1.76g/l。凝血酶原活动度由64.32%降低至28.28%。HE病理染色及Masson纤维染色显示肝组织出现明显的纤维增生和较典型的假小叶,肝细胞可见浊肿,并见部分炎性细胞浸润。模型制备成功率为55%。实验结论应用皮下注射CCL4的方法可成功地建立兔急性肝损伤和肝硬化动物模型。但肝硬化模型制作时间长,动物死亡率高。实验目的评价自体骨髓干细胞经肝动脉移植对兔急性肝损伤模型的治疗作用,并观察促肝细胞生长素在干细胞移植治疗中的作用。材料和方法新西兰雄性大白兔15只,每日皮下注射50%CCL4橄榄油溶液0.8ml/kg连续4天制作急性肝损伤模型。模型形成后将动物随机分为2个实验组和对照组(各5只),3天后实验组经兔胫骨抽取骨髓约5ml,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(干细胞),制成5ml细胞悬液。动物麻醉后在透视下股动脉穿刺插管将分离的骨髓干细胞经肝动脉注入肝脏。实验2组在干细胞移植前后隔日静脉注射促肝细胞生长素(pHGF)2.0mg/kg,共持续20天。干细胞移植后2周、4周、8周分别抽血进行肝功能检测,8周后取兔肝脏组织标本进行病理学观察。实验结果连续注射CCL44天后,血清肝酶及总胆红素明显上升,病理显示肝组织结构紊乱,大量肝细胞坏死、水肿和脂肪变性,汇管区及周围有大量炎性细胞浸润。骨髓干细胞肝动脉移植后肝功能逐渐改善,至移植后8周,血清AST、ALT活性和TBIL含量显著低于对照组(P＜0.05),而TP、ALB含量明显高于对照组(P＜0.05),而且实验2组上述指标改变更明显,与对照组和实验1组之间均有明显差异。病理组织学观察实验组肝脏组织结构清楚,细胞排列规则,二组之间无明显差别,而对照组有纤维组织增生和肝细胞变性。免疫组化染色发现肝组织内散在分布有不同数量的CD34+肝样细胞,并且这些肝细胞在各组数量差异较大,对照组每高倍镜视野约1～2个,干细胞移植组3～5个,移植+pHGF组6～8个。实验结论1.自体骨髓干细胞经肝动脉移植对兔急性肝损伤模型有明显治疗作用,可改善急性肝损伤动物的肝功能,并促进肝组织结构重建。2.促肝细胞生长素(pHGF)能保护肝细胞,促进干细胞在肝脏内的归巢和分化,加速肝组织的修复和肝功能的改善。实验目的评价自体骨髓干细胞经肝动脉移植对兔肝硬化模型的治疗作用,并比较促肝细胞生长素在干细胞移植治疗中的协同作用,为干细胞移植的临床应用提供实验研究基础。实验方法用皮下注射四氯化碳(CCl4)橄榄油溶液的方法复制兔肝硬化模型,模型动物分为实验1组、实验2组和对照组。在无菌条件下从兔胫骨上端抽取骨髓4～5ml,采用密度梯度离心法分离纯化骨髓干细胞,然后在透视下将分离的骨髓干细胞经肝动脉移植于肝脏。术后实验2组隔日静脉内注射pHGF2mg/kg共20天,然后在移植后4、8、12周分别检测肝功能,12周行肝脏病理学检查。实验数据资料采用SPSS11.5统计软件处理,P＜0.05为差异有显著性。实验结果在干细胞移植12周后,动物谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)逐渐降低,;总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)逐渐升高,部分凝血酶原时间(APTT)逐渐上升,但这些改变与对照组相比无差异显著性(P＞0.05)。而移植+pHGF组肝功能指标改变较移植组迅速,与对照组相比有明显差异(P＜0.05)。病理学检查显示干细胞移植组肝细胞形态较规整,无明显水肿和变性,假小叶结构仍存在,但肝组织纤维化程度较对照组明显,形态上有较明显的差异。免疫组化染色发现肝组织内散在分布有CD34+肝样细胞,并且这些肝细胞在各组数量差异较大,对照组每高倍镜视野约2～3个,干细胞移植组3～6个,移植+pHGF组6～9个。实验结论1、自体骨髓干细胞移植对肝硬化有一定的治疗作用。2、促肝细胞生长素可促进干细胞在肝脏的归巢与分化,与骨髓干细胞移植有协同治疗作用。