论文部分内容阅读
前言ERK信号途径的激活与肿瘤的发生有密切关系,ERK是一种与细胞增殖和凋亡相关的重要信号蛋白,也是控制乳腺癌进展的关键点。ERK通过磷酸化抗凋亡分子,同时激活转录因子以刺激表达存活相关基因而产生抗凋亡作用,同时ERK通过磷酸化反应可调节某些转录因子的活性,这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录,引起特定蛋白的表达或活性改变,最终调节细胞代谢和功能,影响细胞产生特定的生物学效应。NSAIDs是一类广泛应用于临床的解热镇痛抗炎药,其作用机制是抑制环氧合酶,阻断花生四烯酸(arachidonic acid, AA)前列腺素(prostaglandins, PGs)的生物合成,从而发挥其抗炎作用。本研究通过观察不同浓度的萘普生钠对体外培养的乳腺癌细胞的凋亡情况,明确该药物对乳腺癌细胞的促凋亡作用,同时通过Western blot方法检测ERK及P-ERK的表达,明确药物促凋亡作用的途径和方式。材料和方法一、材料细胞株MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌细胞株为中国医科大学病理学教研室冻存。二、主要试剂浓缩型兔抗人ERK1/2单抗(L352)购于美国Bioworld公司,浓缩型兔抗人P-ERK1/2单抗(Y204)购于美国Bioworld公司。浓缩型辣根酶标记的羊抗兔抗体(BS10350)购于美国Bioworld公司。流式细胞仪试剂盒购于欣博盛公司。三、实验方法(一)细胞培养和分组分别培养乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,两种乳腺癌细胞各分为四组,分别为对照组、低浓度药物处理组、中等浓度药物处理组和高浓度药物处理组。对照组、低浓度药物处理组、中等浓度药物处理组和高浓度药物处理组分别对应药物浓度为Ommol/L、1mmol/L、5mmol/L和10mmol/L。(二)流式细胞仪检测凋亡采用Annexin V/PI双染色法,流式细胞仪(BDFACScalibur)分析,结果采用Cellquest软件分析处理。(三)Western blot常规收集不同浓度萘普生钠作用24 h后的MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌细胞,冷冻离心取上清液分装,Bradford法测定细胞提取物的蛋白浓度。以特异性识别双磷酸化ERKl/2的抗体检测磷酸化ERK1/2的量；以抗总ERK1/2抗体检测总ERK1/2的量为内对照。用SDS-PAGE电泳结束后,将PVDF膜放人封闭缓冲液,室温封闭1 h,加入兔抗人ERK-1/2抗体及兔抗人P-ERK抗体,过夜,加人HRP标记的羊抗兔IgG,将Western印迹试剂均匀涂于PVDF膜上,倾去发光试剂,用保鲜膜盖于PVDF膜上一暗室内将x线片置于保鲜膜上,冲洗x线片,拍照及进行计算机图像分析,应用BandScar5.0软件进行结果灰度值检测。(四)统计学分析应用SPSS 12.0统计软件进行统计分析,采用t检验方法分析各组Western blot图像灰度值和流式细胞仪凋亡率,P<0.05为具有显著性差异。结果1、流式细胞仪结果MCF-7和MDA-MB-231两组间比较P>0.05,未见统计学差异；不同浓度药物处理各组间P<0.05,具有显著性统计学差异；同时药物浓度与细胞凋亡率具有明显相关性。2、Western blot结果不同药物浓度各组间ERK表达比较P>0.05,未见统计学差异,而P-ERK表达则P<0.05,具有显著性统计学差异,同时药物浓度与P-ERK表达具有明显负相关。讨论ERK1/2是由Boulton等于90年代初期先后分离鉴定的一种蛋白激酶,ERK可通过磷酸化反应可调节某些转录因子的活性,这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录,引起特定蛋白的表达或活性改变,最终调节细胞代谢和功能,影响细胞产生特定的生物学效应。ERK信号途径的激活与肿瘤的发生有密切关系,ERK是一种与细胞增殖和凋亡相关的重要信号蛋白,也是控制乳腺癌进展的关键点。MAPK信号转导通路参与多种细胞功能的调控,尤其是在细胞增殖、分化与凋亡中,起着关键作用。本研究证实乳腺癌细胞凋亡与P-ERK的表达具有明显相关性,而与ERK的表达没有明显相关性,表明ERK磷酸化途径是乳腺癌细胞抗凋亡的关键途径之一。NSAIDs是一类广泛应用于临床的解热镇痛抗炎药,近年来,关于NSAIDs的抗肿瘤的作用,已经成为人们的研究热点。本研究通过不同药物浓度处理乳腺癌细胞观察,发现萘普生钠具有明显的乳腺癌细胞的促凋亡作用,并且该作用随药物浓度的增加而增强。通过对雌激素受体阳性MCF-7和雌激素受体阴性MDA-MB-231乳腺癌细胞的ERK及P-ERK表达检测,发现萘普生钠对两种细胞ERK的表达没有明显的影响,而对P-ERK的表达具有显著的抑制作用,同时该抑制作用随药物浓度的增加而增强,具有明显的相关性,与雌激素受体无相关性,从而表明萘普生钠可通过抑制ERK磷酸化途径,减少P-ERK的表达,促进乳腺癌细胞的凋亡。结论1、萘普生钠对ERK的表达没有明显的影响,而对P-ERK的表达具有显著的抑制作用,同时该抑制作用随药物浓度的增加而增强,具有明显的相关性。2、萘普生钠可通过抑制ERK磷酸化途径,减少P-ERK的表达,促进乳腺癌细胞的凋亡。