背景和目的神经元的轴突导向作用是神经元与靶细胞建立相互联系的基础，而神经元的轴突生长锥是轴突发挥导向和生长的关键部位。生长锥对轴突的生长和路径寻找是至关重要的。CDK5是一种脯氨酸介导的丝/苏氨酸激酶，它不仅是神经系统发育的关键分子，也是轴突生长和导向的重要调节因子。研究证实，CDK5可对不同的信号传导通路上靶蛋白的磷酸化参与脑发育早期神经细胞轴突分化、生长及导向等神经系统发育事件的调节，并在神经系统退行性疾病、DNA损伤、神经系统肿瘤等病变中起重要作用。目前它已被证实可以通过磷酸化多种轴突生长锥蛋白来调节轴突的功能。在神经系统发生病变的情况下，神经元轴突的退变和萎缩往往是最早期变化之一，但其机理尚不清楚。因此深入研究轴突生长锥的磷酸化蛋白质组学，运用生物信息学软件预测CDK5激酶的磷酸化位点并绘制CDK5在轴突生长锥的底物图谱，可为系统揭示核心激酶CDK5在神经元轴突调节中的分子作用机制提供依据，为全面理解CDK5对神经元轴突调节机制奠定基础，为解决神经损伤和神经系统退行性疾病提供新的靶点和思路，为开发和设计有利于神经再生的药物提供新思路。方法本实验中参考Karl H. Pfenningers等发表的关于神经元轴突生长锥的提取方法[1]，取胚胎16-18天的小鼠，分离出大脑皮层组织，将大脑皮层组织用0.32M蔗糖的匀浆液匀浆后，首先进行1600×g低速离心15min，取上清，然后分别采用0.83M、1.0M和2.66M的梯度蔗糖缓冲液进行梯度密度超速离心。离心结束后各管均可见明显分层，而轴突生长锥锥蛋白位于0.32M与0.83M之间。将该层组织小心取出后，对蛋白进行提取、定量和消化并采用TiO2法富集含有磷酸化肽段，通过ESI-QUAD-TOF质谱技术进行磷酸化肽段的检测。采用“激酶-底物”预测软件GPS2.1和Scansite3来预测CDK5可能的磷酸化位点，并且与质谱检测到的位点进行比对，综合两种软件最后的预测结果，筛选出与两种软件都相符合的位点。并对相对应的蛋白进行分类筛选，选出与轴突生长和导向相关的蛋白进行体外验证。选取该位点前后5个氨基酸组成的含有11个氨基酸的肽段，体外合成含有双酶切位点粘性末端的长度共为39个碱基的DNA序列。并且同时合成将该位点突变为丙氨酸的相同长度的引物序列作为对照。将这两条DNA引物序列通过基因重组插入GST-PGEX-6P-1载体中，用BL21感受态细胞进行转化扩增，并诱导蛋白，再通过体外激酶反应和免疫印迹等经典分子生物学技术对于质谱和生物信息学预测的结果进行实验验证。结果本实验中共用了10只孕鼠，共计胎鼠数量为120只，胎鼠皮层蛋白湿重约5g，共分4管进行梯度密度蔗糖超速离心，离心结束后，每管均有肉眼明显可见的分层，用Bradford蛋白定量法测得轴突生长锥蛋白总量为2.5mg。质谱共检出178617条信息，采用Mascot检索，uniprot-mouse数据库中鉴定到的总蛋白为3837个，去伪存真后， unique肽段有11881个，磷酸化蛋白数1508个。磷酸化位点数36587条，磷酸化的丝氨酸位点数为20833个，苏氨酸位点数为13162个，酪氨酸位点数为2592个，各占比例分别为57%，36%，7%。用GPS2.1和Scansite中的高严谨度对质谱结果中的各个蛋白进行分析，预测它们被CDK5磷酸化的可能位点，结果发现与GPS2.1预测结果吻合的位点数为2614个，而与Scansite预测的位点相符合的共有282个。同时与GPS2.1和Scansite3两种软件的预测结果相吻合的位点数有190个。通过在线PhosphoSitePlus分析以及文献检索，对这190个的位点进行逐类分析。发现其中大多数的位点是未被实验验证过的新的位点。在9个已被单点验证过的位点中，只有3个是CDK5磷酸化的位点。通过蛋白功能分类发现，其中比例最多的蛋白类型为激酶类蛋白、骨架类蛋白和未知功能的蛋白，按类别分别选取了其中与轴突生长和导向相关的2种蛋白进行实验验证。对这2种蛋白进行体外磷酸化单点验证。DNA测序结果表明目的DNA片段已成功插入载体中。考马斯亮蓝染色后也验证了蛋白体外成功诱导表达。激酶反应和免疫印迹的结果也证实这2种蛋白可以在体外被CDK5磷酸化，从而验证了生物信息学的预测结果。结论本研究通过高通量蛋白质谱技术和生物信息学相结合的方法绘制了CDK5在轴突生长锥的底物图谱，并对预测的CDK5重要底物位点进行体外激酶反应验证。为进一步研究神经元轴突生长锥蛋白的分子作用机制提供了参考，为解决神经损伤和神经系统退行性疾病提供新的靶点和思路。