使用杀虫剂是防治农作物害虫的重要手段,杀虫剂发挥杀虫作用的前提是必须进入害虫体内,并经血淋巴转运到分子靶标干扰害虫的某个重要生理过程,从而起杀虫作用。然而,关于杀虫剂在昆虫体内的转运机制并不清楚,杀虫剂进入血淋巴后怎样被运送到作用靶标仍是未解之谜。本研究将探讨甜菜夜蛾体内某些运载蛋白与杀虫剂运输的关系,以填补杀虫剂毒理学领域的这一缺失环节。首先开展了甜菜夜蛾载脂蛋白D（SeApoD）、虫青素（SeIns）和脂蛋白Ⅲ（SeLpⅢ）基因的克隆,对这些基因编码蛋白的结构特征进行了分析;测定了这些基因的组织表达特性以及抗性与敏感种群间的表达差异;利用原核表达技术获得了可溶性的表达蛋白,据此开展了蛋白与杀虫剂结合亲和性的研究。具体研究结果如下:一、甜菜夜蛾载脂蛋白D、虫青素等基因的结构特征通过基因克隆,得到了 10个甜菜夜蛾基因,其中4个载脂蛋白D基因、1个脂蛋白Ⅲ基因和5个虫青素基因。利用NCBI线上工具CDSearch预测这些蛋白的结构域,结果表明,载脂蛋白D与虫青素编码蛋白均含有脂质运载蛋白家族的保守结构域“lipocalinapoD”,属脂质运载蛋白超家族的成员,其推定氨基酸序列均含有四个保守的半胱氨酸位点,表明其具有典型载脂蛋白D或虫青素的结构特征。脂蛋白Ⅲ含有脱辅基脂蛋白Ⅲ家族的保守结构域“ApoLp-Ⅲsuper family”,是属于脱辅基脂蛋白Ⅲ家族成员。同时,我们还对载脂蛋白D和虫青素的系统进化关系进行了分析。二、甜菜夜蛾载脂蛋白D、虫青素等基因的表达规律在获得基因序列的基础上,采用RT-qPCR技术,分析了载脂蛋白D、虫青素等基因在甜菜夜蛾幼虫的头、表皮、中肠、脂肪体和血淋巴这5个组织中的相对表达水平。结果表明,在甜菜夜蛾幼虫的各个组织中,4个载脂蛋白中SeApoD1与SeApoD2以血淋巴中的表达水平最高,其次是在脂肪体中,而SeApoD3和SeApoD4主要富集在幼虫头部表达;SeIns1在中肠与头部均有较高水平表达,SeIns2则主要在脂肪体与血淋巴中表达,SeIns3与SeIns4仅在血淋巴中高水平表达,SeIns5以头部表达最高,其次是血淋巴中。还比较了高效氯氟氰菊酯抗性种群与敏感种群间的表达水平差异,结果表明,SeApoD2、SeApoD3、SeApoD4、SeIns1、SeIns4 与 SeIns5 的表达水平在抗性种群中有显著地上调,而SeLpⅢ的表达水平却在抗性种群中显著下调。这些基因的组织表达特性为进一步探索其生理功能提供了理论依据,抗性种群中基因的上调表达与抗药性可能有一定联系。三、甜菜夜蛾载脂蛋白D、虫青素等基因的原核表达及其与杀虫剂的亲和性分析以PET-30a为原核表达载体,BL21为宿主细胞,通过原核表达技术获得载脂蛋白D与虫青素等蛋白。在0.5mM IPTG浓度下25℃诱导11h,获得了SeApoD4和SeIns1的可溶性蛋白,其余8种蛋白在包涵体中。将诱导温度降低到16℃后培养18h得到可溶性的SeLpⅢ与SeApoD3蛋白。采用亲和层析和透析技术纯化得到4种蛋白:SeApoD3、SeApoD4、SeIns1与SeLpⅢ。利用纯化得到的可溶蛋白,使用微量热泳动技术分析了这些蛋白与杀虫剂的亲和性。结果表明,虫青素SeIns1以及载脂蛋白SeApoD4与高效氯氟氰菊酯具有很高的结合亲和性,解离常数Kd值分别为0.18μM与9.04 μM;SeApoD3与高效氯氟氰菊酯也具一定的结合亲合性,Kd值为49.81 μM,但脂蛋白SeLpⅢ与该杀虫剂的亲和性很弱,Kd值为0.72 mM,说明该脂蛋白不能与此药剂结合。毒死蜱与这4种血淋巴蛋白的分析结果表明:载脂蛋白SeApoD3、脂蛋白SeLpⅢ与毒死蜱有较强的结合亲和性,解离常数Kd值分别为10.12 μM与4.14μM。虫青素SeIns1以及载脂蛋白SeApoD4与毒死蜱的结合亲和性都比较弱,解离常数Kd值分别为105.42 μM与1.4 mM。以上结果表明载脂蛋白和虫青素等蛋白可能参与了毒死蜱和高效氯氟氰菊酯在甜菜夜蛾体内的转运。综上所述,本研究对甜菜夜蛾的脂质运载蛋白进行了全面而系统的挖掘,理清了鳞翅目昆虫中这类蛋白的系统发生与演化情况;从这类基因的编码蛋白中,首次发现了与杀虫剂有高亲和性的脂质运载蛋白,并且这种杀虫剂结合蛋白在抗性种群中还显著的上调表达。昆虫体内杀虫剂结合蛋白的发现与鉴定,解答了一直悬而未决的杀虫剂在血淋巴中是怎样转运的这一毒理学问题,对解密害虫的抗药性机制有重要理论意义。