论文部分内容阅读
雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）是一种重要的药用植物,具有抗癌、抗炎、调节免疫系统等作用,并具有较强的杀虫活性。雷公藤红素（celastrol）是雷公藤最具代表性的三萜物质,药理活性高,作用广泛,极具开发价值。鲨烯合酶（Squalene synthase,SQS）、鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase,SE）、环氧角鲨烯环化酶（Oxidosqualene cyclases,OSC）被认为是三萜类次生代谢途径中的关键限速酶,是三萜合成生物学研究的重要元件之一。根据前期对雷公藤根转录组数据的分析设计引物,克隆得到1个鲨烯合酶（TwSQS）、2个鲨烯环氧酶编码（TwSE1、TwSE2）、4个环氧角鲨烯环化酶（TwOSC1、TwOSC2、TwOSC3、TwOSC4）基因,对它们进行基本生物信息学分析。荧光定量PCR（real-time PCR）方法检测它们在雷公藤不同组织部位的表达模式,以及在雷公藤发状根中受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导处理后基因的表达量变化,结合HPLC检测雷公藤红素含量的变化。主要结果如下:1.TwSQS基因的开放阅读框（Open reading frame,ORF）为1242 bp,编码413个氨基酸。将C-末端最后28个氨基酸截短的TwSQS基因连接pET-30a（+）载体,转化Transetta（DE3）表达宿主菌中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示得到可溶性蛋白,分子量约为49.41 kDa。粗蛋白经过纯化后,体外酶促反应表明大肠杆菌中表达并纯化的可溶性TwSQS蛋白能够在Mg2+和NADPH的配位作用下催化FPP生成角鲨烯,具有鲨烯合酶催化活性。TwSQS在不同组织中均有表达,在根中的表达量最高。经MeJA诱导后,TwSQS表达量迅速上升,于诱导后6 h达到最高值,随着诱导时间的延长表达量逐渐下降,但表达量仍显著高于0 h的表达量。2.TwSE1和TwSE2的ORF分别为1578和1584 bp,分别编码525和527个氨基酸,两条序列相似性为76.18%,但N端序列不保守。TwSE1、TwSE2基因在雷公藤不同组织中均有表达,TwSE1在花中表达丰度最高,在根中表达丰度最低;但TwSE2在花和嫩叶中表达量最高,在老叶中表达量最低,且TwSE2在各组织部位的表达量都低于TwSE1。MeJA诱导后,TwSE1、TwSE2基因表达量均上升,都表现为表达量先上升后下降再上升的趋势,于诱导后3 h达到一个高水平表达,之后下降,在诱导12 h后表达量又迅速上升;在相同诱导条件下,TwSE2基因表达水平的提高小于TwSE1基因。3.TwOSC1、TwOSC2、TwOSC3的ORF均为2289 bp,编码762个氨基酸;TwOSC4的ORF为2280 bp,编码759个氨基酸。4个TwOSC基因序列相似性较高,多重序列比对,相似性达72.06%。TwOSC1基因的组织表达特异性非常强,只在根中表达,但TwOSC2、TwOSC3和TwOSC4在不同组织中均有表达。TwOSC2在根中表达量最高,在其余4个组织中表达量相当低于根中的表达量。TwOSC3在老叶中表达量最高,在根和茎中表达量最低。TwOSC4在叶中表达量较低,在根、茎和花中表达量相当但高与叶。4个TwOSC均响应MeJA的诱导,但对每个基因的诱导程度不同。TwOSC1基因在MeJA诱导后前6 h表达量没有明显的变化,随着诱导时间的延长表达量逐渐上升。TwOSC2基因于诱导后6 h达到最高值,随着诱导时间延长表达量逐渐降低。MeJA的诱导表现出抑制TwOSC3基因的表达,相对表达量在3 h内有一个短暂的上升,之后表达量显著下降,诱导12 h后表达量有所上升,但是仍低于未诱导前的表达量。TwOSC4基因在MeJA诱导后表达量变现出先上升后下降的再上升的趋势,在MeJA诱导12 h后表达量显著上升。4.HPLC检测雷公藤不同组织部位中红素的含量,只在雷公藤根中检测到红素的含量。雷公藤发状根经MeJA诱导处理后的48 h内,红素含量有不同程度的增加,MeJA诱导后前6 h红素含量增加不明显,之后红素含量显著增加,并于诱导后24 h达到最高值。MeJA诱导后TwOSC1基因表达量的变化和红素含量的变化趋势一致,TwOSC1基因也只在雷公藤根中表达,推测TwOSC1可能与雷公藤红素的合成有关。