异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)是一类在三羧酸循环中发挥关键作用的酶家族。人类基因组有5种IDH基因,可编码生成三种异柠檬酸脱氢酶(IDH1、IDH2及IDH3),其中IDH2位于线粒体,催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH。已有研究表明在不同肿瘤中存在各种IDH突变体,包括急性髓细胞白血病(AML)、脑肿瘤、神经胶质瘤等,其最为常见的突变碱基位于R132(IDH1)、R140与R172(IDH2)。IDH突变体将α-KG转化生成肿瘤代谢物2-羟戊二酸(2-HG),从而紊乱了一系列α-KG依赖性双加氧酶反应。具体表现为:促进组蛋白赖氨酸甲基化;抑制10-11易位酶家族(TET)羟甲基化,进而激活CpG岛的DNA甲基化;稳定缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达,上调血管内皮生长因子(VEGF)。目前与癌症发生和增殖密切相关的IDH2突变体的结构、功能及稳定性的研究鲜有报道,本课题通过分析不同突变体的IDH2结构、功能与稳定性,将对深入理解IDH2突变导致肿瘤发生、增殖的分子机制及其诊疗提供一些线索和参考。本研究选用哺乳细胞表达载体pCMV6-AC-Myc-His,通过基因克隆、重叠PCR、双酶切鉴定与测序成功构建11个IDH2重组表达载体:WT、R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P。在此基础上,在293T与小鼠小胶质细胞BV2中瞬时转染过表达IDH2野生型与不同突变体,检测蛋白表达与相关信号通路(Western)、细胞代谢(检测酶活力、葡萄糖及乳酸、ROS变化)、蛋白降解(Western)、蛋白质与热激蛋白90相互作用(免疫共沉淀)等实验,通过生物信息学同源模型构建,分析突变对IDH2结构的影响,并与药物导致蛋白降解的结果进行相互验证与比对,探究IDH2野生型和突变体之间结构、功能与稳定性的差异。结果表明:1)野生型与突变体R140/R172在293T和BV2细胞中表达水平具有明显差异;2)突变体IDH2酶活力显著低于野生型;3)在293T细胞中,与野生型IDH2相比较,R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突变体过表达降低细胞乳酸含量,R172S、R172K、R172W、R172G突变体过表达导致葡萄糖含量升高,R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C突变体ROS含量均显著降低;不同突变体的过表达对细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路影响不同,其中多个突变体过表达抑制pAKT和pS6的表达,并导致Cyclin D1表达下调;这些结果表明突变体IDH2过表达减缓了细胞代谢与生长。而在BV2细胞中,过表达R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突变体增加了TNF-α表达;其中R172S、R172M、R172W、R172G突变体过表达诱导IL-6表达,推测这些突变体的过表达可能与炎症反应的发生有一定的关联;4)泛素化蛋白连接酶抑制剂Bortezomib对野生型IDH2表达无影响,而对突变体R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K表达敏感,促使其蛋白降解;对过表达的突变体R172M、R172W、R172G、R172C、R172P具有耐药性,药物处理过后的表达水平并没有发生明显变化。同源模建结构分析表明相应的点突变影响了蛋白质的结构。HSP90抑制剂17-AAG对突变体IDH2过表达并无影响,免疫共沉淀结果表明HSP90与IDH2无相互作用。以上研究将可能为IDH2作为标靶提供一些重要的信息与理论依据。