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实验一人成釉蛋白C端肽的原核诱导表达及表达条件的优化目的:对人成釉蛋白C端肽原核表达条件进行优化,以获得高表达量的AMBN-C重组蛋白。方法:1.将pET15b-AMBN-C重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行培养;2.当OD值达到0.6时,加入诱导剂0.5mM IPTG,在不同温度、时间下培养,SDS-PAGE电泳检测表达情况,蛋白免疫印记法分析目的蛋白的表达,确定pET15b-AMBN-C重组质粒优化的表达条件。结果:1.将pET15b-AMBN-C重组质粒成功转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,对重组表达菌进行大量培养;2.pET15b-AMBN-C重组质粒优化表达条件的确定:通过分析SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印记结果确定为当OD值达到0.6时,加入0.5mM诱导剂IPTG,20℃条件下培养16h,重组蛋白在沉淀中以包涵体的形式表达。实验二AMBN-C重组蛋白的大量表达、纯化及鉴定目的:获得高表达量、高纯度的重组人成釉蛋白C端肽(AMBN-C)。方法:1.AMBN-C重组蛋白在加入0.5mM诱导剂IPTG,20℃条件下培养16h,以包涵体形式大量表达;2.将包涵体进行裂解、洗涤、溶解,得到可溶性AMBN-C重组蛋白;3.可溶性AMBN-C重组蛋白经过透析复性法复性,恢复重组蛋白的正常结构和生物活性;4.将AMBN-C重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳检测。结果:SDS-PAGE电泳检测显示:经镍离子亲和层析纯化后得到AMBN-C重组蛋白,蛋白浓度为0.66mg/ml。实验三AMBN-C重组蛋白引导牙釉质仿生再矿化能力的研究目的:研究AMBN-C重组蛋白引导牙釉质仿生再矿化能力方法:1.采用透射电镜(TEM)观察AMBN-C重组蛋白自组装及其在人工唾液中结晶的单体形态和层级结构;2.使用纯化后的AMBN-C重组蛋白作为仿生矿化的模板,人工唾液中诱导矿化7天,用扫描电镜(SEM)观察新生层的结构、X线衍射(XRD)对新生层进行表征分析。结果:1.AMBN-C重组蛋白溶液的pH由3.5迅速变为7.6时,随着自组装时间的推移,AMBN-C重组蛋白由最开始的单体,慢慢团聚为低聚物,随后进一步自组装为纳米微球,更进一步能组装为串珠网状结构;2.AMBN-C重组蛋白在人工唾液中的pH由3.5迅速变为7.6时,重组蛋白与钙、磷离子发生结晶,蛋白质-矿物聚集体定向聚集形成纳米链,进一步聚集形成板状矿物颗粒聚集;3.AMBN-C重组蛋白作为仿生矿化模板,在人工唾液中引导酸蚀牙釉质的再矿化,通过对新生层的SEM、TEM结果分析表明:自组装的AMBN-C重组蛋白引导生成沿C轴排列的磷灰石晶体;XRD分析对新生层进行表征,进一步确定了新生层为羟基磷灰石晶体沉积。